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1、目的:本研究旨在探討應(yīng)用超聲微泡造影劑作為基因治療的載體,通過(guò)定位釋放技術(shù)將SERCA2a基因通過(guò)微泡造影劑的示蹤作用轉(zhuǎn)移至受損心肌微循環(huán)處,為靶向基因治療探索出一種低創(chuàng)傷、高效以及安全的的基因輸送方法。
方法:將同種屬同窩別同年齡雄性SD大鼠35只,體重為250~300克,隨機(jī)分為分為3組:即假手術(shù)組、心肌梗死組和基因治療組。假手術(shù)組僅開(kāi)胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈;其余兩組結(jié)扎冠脈左前降支近端,造成前壁心梗。將心功能符合要求、且心
2、梗后仍存活的大鼠及假手術(shù)大鼠共計(jì)29只動(dòng)物納入本研究。首先對(duì)心肌梗死組及基因治療組大鼠于心梗術(shù)前、術(shù)后1日、4周和8周進(jìn)行心臟超聲檢查,并按照不同觀察時(shí)間點(diǎn)分為術(shù)前對(duì)照、心梗1日、4周和8周共四組。使用GE Vivid 7 Dimension超聲診斷儀經(jīng)左胸壁進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)圖檢查。分別測(cè)量超聲短軸乳頭肌水平徑向應(yīng)變率(radial strain rate,Srrad)和圓周應(yīng)變率(circumferential strain rate
3、,Srcir)的收縮期峰值應(yīng)變率Srrad-S和Srcir-S,舒張?jiān)缙诜逯祽?yīng)變率(Srrad-E)和Srcir-E,舒張晚期峰值應(yīng)變率Srrad-A和Srcir-A。測(cè)量左室二維超聲指標(biāo)。在心梗術(shù)后4周給予不同干預(yù),即假手術(shù)組及心肌梗死組經(jīng)尾靜脈注射空載超聲造影劑;基因治療組經(jīng)尾靜脈注射rAAV2-SERCA2a基因(1.5×1011vg/ml)和微泡造影劑混合液,輸入液體量均為1.0ml。使用i13L線陣探頭經(jīng)左胸壁進(jìn)行心臟超聲心動(dòng)
4、圖檢查。儀器設(shè)置為低機(jī)械指數(shù)(MI﹦0.4)。當(dāng)心肌組織內(nèi)見(jiàn)微泡造影劑充盈時(shí)立即換成M3S探頭,探頭頻率為2.0~3.5 MHz,啟用二次諧波功能,發(fā)射頻率為1.3MHz,接收頻率為2.6 MHz并進(jìn)入反向編碼實(shí)時(shí)心肌造影模式,使機(jī)械指數(shù)調(diào)至1.02,利用FLASH(fast low-angle shot,F(xiàn)LASH)功能破壞心腔及心肌組織中的造影劑微泡,并進(jìn)行心電觸發(fā),每三到六個(gè)心動(dòng)周期觸發(fā)一次,以達(dá)到定點(diǎn)爆破造影劑微泡的目的。每觸發(fā)
5、一次間隔2~5S,以利于下一心動(dòng)周期有足夠的超聲造影劑進(jìn)入心肌組織內(nèi)。于超聲爆破干預(yù)4周之后,檢測(cè)左室心功能,處死大鼠,分別取出大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及大腦組織于冰凍管內(nèi),以RT-PCR和Westen印跡法檢測(cè)各組大鼠各主要臟器內(nèi)SERCA2a基因mRNA及蛋白表達(dá)量。以雙夾心ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、Ang II、ANP、ET-1以及IL-6等神經(jīng)內(nèi)分泌因子水平。并檢測(cè)了反映大鼠肝腎功能的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT
6、/GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)、血尿素氮(BUN)以及血肌酐(Cr)血清濃度。
結(jié)果:心梗1日組Srrad-S、Srrad-E、Srci-S及Srci-E在前壁和側(cè)壁較心梗手術(shù)前相應(yīng)節(jié)段降低。心梗4周組和心梗8周組Srrad、Srcir在各節(jié)段較心梗手術(shù)前相應(yīng)節(jié)段均降低。心梗8周組左室心肌各節(jié)段Srrad、Srcir與心梗4周時(shí)相比幾無(wú)差別。在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)4周之后,治療組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑LVDd較安慰劑組大鼠組顯
7、著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);治療組大鼠LVFS、EF則較安慰劑組大鼠組恢復(fù),而與假手術(shù)組無(wú)差別。應(yīng)用斑點(diǎn)追蹤成像技術(shù)對(duì)各組大鼠心肌功能評(píng)價(jià),證實(shí)在SERCA2a基因轉(zhuǎn)導(dǎo)4周之后,基因治療組大鼠乳頭肌水平各節(jié)段徑向、圓周收縮期舒張?jiān)缙趹?yīng)變率左均高于心肌梗死組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而與假手術(shù)組無(wú)差別?;蛑委熃M徑向、圓周舒張晚期多數(shù)節(jié)段應(yīng)變率較心肌梗死組有不同程度改善。此外,基因治療組二尖瓣、心尖水平短軸最大收縮
8、期旋轉(zhuǎn)角度及左室扭轉(zhuǎn)角度均高于心肌梗死組(P<0.01);而與假手術(shù)組無(wú)差別。此外,RT-PCR以及Westen印跡法表明,在接受超聲干預(yù)4周之后,基因治療組大鼠心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)較心肌梗死組明顯增加(P<0.05),而與假手術(shù)組無(wú)差別。對(duì)基因治療組和心梗對(duì)照組大鼠其他組織間SERCA2a蛋白的表達(dá)進(jìn)行比較,除基因治療組大鼠肺臟組織SERCA2a蛋白的表達(dá)高于心肌梗死組外(P<0.05),其余各組織兩組間SERCA2a蛋白的
9、表達(dá)無(wú)差異。以雙夾心ELISA法檢測(cè)了各組大鼠血清,基因治療組大鼠Ang II,ET-1以及ANp神經(jīng)內(nèi)分泌因子血清濃度較心肌梗死組大鼠有所恢復(fù);而IL-6、TNF-α血清濃度則低于心肌梗死組大鼠,與假手術(shù)組大鼠濃度無(wú)差別。此外,基因治療組大鼠GPT、GOT、BUN以及Cr與假手術(shù)組無(wú)差別。
結(jié)論:心梗大鼠不同時(shí)間段左室心肌功能各具特點(diǎn),心梗4周后出現(xiàn)非梗死心肌功能失代償改變是其重要特征。超聲靶向微泡造影劑介導(dǎo)rAAV2-
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