紫杉肽中紫杉醇含量分析研究.pdf

1、目的：
　　紫杉醇是從紅豆杉中提取的抗腫瘤藥物，水溶性較差。紫杉肽是紫杉醇的聚合衍生物，是在紫杉醇C13側鏈的2'位上通過酯鍵與多肽聚合而成，分子量在10～40 kDa范圍內。紫杉肽表現(xiàn)出良好的水溶性和抗腫瘤活性。紫杉肽中紫杉醇含量分析方法的建立對紫杉肽研發(fā)具有重要意義，雖然可以通過紫杉肽制備過程中的投料量確定紫杉醇理論含量，但是，紫杉肽的分子量不均一且結構復雜，難以對其中紫杉醇的含量進行準確測定，未見國內文獻報道利用色譜法測定紫

2、杉肽中紫杉醇含量。本研究旨在建立紫杉肽中紫杉醇含量的體內、外分析方法，為紫杉肽的藥學資料研究、毒理學、藥理學研究和臨床研究中的含量分析提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　在紫杉肽中包括與多肽鏈結合的結合型紫杉醇和未與多肽鏈結合的游離型紫杉醇。首先，建立游離紫杉醇的含量分析方法，紫杉肽經液-液萃取法萃取其中游離紫杉醇后，通過HPLC法檢測分析;分別通過不同種類蛋白酶和不同pH溶液水解連接紫杉醇和多肽鏈的酯鍵，以液-液萃取法萃取其中

3、紫杉醇后，HPLC法檢測分析，通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較，初步確定水解反應的效率;通過對紫杉肽在不同溶液中水解規(guī)律的研究，發(fā)現(xiàn)紫杉肽及紫杉醇在pH＞13.0溶液中極不穩(wěn)定，將反應后溶液分離、純化后，得到紫杉醇的單一水解產物，通過對紫杉醇穩(wěn)定且特有的水解產物的鑒定和檢測分析，間接對紫杉肽中紫杉醇含量進行測定。
　　結果：
　　1.紫杉肽中游離紫杉醇含量測定及方法學確證。
　　紫杉肽中游離紫杉醇以乙醚萃取后，參考《中

4、華人民共和國藥典》二部（2010版）紫杉醇注射制劑含量分析方法，建立了紫杉醇HPLC分析方法，采用Thermo Hypersil GOLD(4.6×150 mm，5μm)色譜柱，流動相為乙腈∶水(50∶50，v/v)，檢測波長為227 nm。實驗結果表明，該方法專屬性、重復性和穩(wěn)定性良好，簡單、易操作，適用于紫杉醇的含量分析研究。測得5個批次紫杉肽中，每瓶含游離紫杉醇的量在21.6～79.2μg范圍內。
　　2.紫杉肽中結合型紫杉

5、醇解離實驗。
　　紫杉肽分別經枯草桿菌蛋白酶、嗜熱桿菌蛋白酶和pH1.9～13.0溶液水解處理后，以乙醚萃取其中紫杉醇并檢測分析，通過與紫杉肽中紫杉醇理論含量比較，計算水解比率。結果表明，不同溶液中紫杉肽的水解比率各不相同:紫杉肽經嗜熱桿菌蛋白酶處理后，測得酶解率為10.57％，紫杉肽經枯草桿菌蛋白酶處理后，測得酶解率為12.49％;紫杉肽經pH9.2溶液處理后，測得紫杉醇量最高，約占紫杉醇理論含量的23.29％。兩種方法測得結果

6、均與紫杉肽中紫杉醇理論含量相差較多，可能原因有紫杉醇在處理條件下不穩(wěn)定和處理過程不徹底。因此，以上兩種方法未能將紫杉肽中的紫杉醇穩(wěn)定可控的解離，從而實現(xiàn)紫杉肽中紫杉醇含量分析的目的。當以pH為13.0溶液溶解紫杉肽后，未檢測到紫杉醇，說明紫杉醇在該條件下極不穩(wěn)定。
　　3.紫杉肽和紫杉醇堿性條件下水解產物分析。
　　通過紫杉肽在不同溶液中水解過稱研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇和紫杉肽在pH＞13.0條件下易水解，生成一系列化合物，通過液相

7、色譜方法對紫杉醇的系列水解產物分離純化，制備了約5.7 mg單一水解產物。通過質譜和1HNMR初步推斷其結構，在購得相應標準品后，通過UPLC、UV和MRM等方法對其結構進行了確證，最終確定該水解產物為紫杉醇母核13'位上側鏈的羧酸鈉。分子式為:C16H14NNaO4;分子量為:307.08。
　　4.紫杉肽中紫杉醇含量測定及方法學確證。
　　紫杉肽和紫杉醇經0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液水解后，以Agilent1290

8、UPLC檢測分析，采用Waters BEH C18(2.1×50 mm，1.7μm)色譜柱，流動相為乙腈∶水(10∶90，v/v)，檢測波長為227 nm。紫杉醇標準品經水解后，與相同物質的量濃度的紫杉醇C13側鏈標準品比較，結果測得峰面積之比與理論值的偏差為-0.70％，說明紫杉醇的水解反應是徹底的;分析方法準確、重現(xiàn)性好，滿足藥典規(guī)定藥物含量測定方法學要求。測得5個批次紫杉肽中，每瓶中紫杉醇含量在31.80～37.38mg范圍內。<

9、br>　　5.血漿樣品中紫杉肽分析方法的建立及方法學確證。
　　紫杉肽樣品和紫杉醇溶液與人血漿混合后，用0.2 mol.L-1氫氧化鈉水解處理，再以兩倍體積乙腈除去樣品中的蛋白質后，通過UPLC-MS/MS法檢測分析。通過對紫杉醇與紫杉肽共有的水解產物的測定，實現(xiàn)了對血漿樣品中紫杉肽的紫杉醇含量準確測定的目的。結果表明，該方法水解反應穩(wěn)定徹底，靈敏度高，專屬性、重復性和穩(wěn)定性良好，測得5個批次紫杉肽中，每瓶中紫杉醇含量在31.85