產(chǎn)紫杉醇真菌的鑒定及疑似紫杉醇基因的克隆.pdf

1、紫杉醇是一種高效、低毒、廣譜、作用機(jī)制獨(dú)特的天然抗腫瘤藥物。紫杉醇產(chǎn)生菌是一類內(nèi)生真菌，主要指從紅豆杉等樹上分離出來的一類可產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌。由于紫杉醇產(chǎn)生菌的發(fā)現(xiàn)為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇提供了可能性，因此，對(duì)紫杉醇產(chǎn)生菌的研究近年來得到了廣泛的重視。
　　 本文首先對(duì)從哈爾濱、合肥等地分離自杉樹、柏樹、海棠的6株疑似紫杉醇產(chǎn)生菌(05a、07c、31b、48c、62c、71a)的紫杉醇產(chǎn)生能力進(jìn)行了鑒定。經(jīng)過TLC法初步鑒

2、定，其發(fā)酵產(chǎn)物中含有與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同遷移率(Rf值)的物質(zhì)；HPLC分析結(jié)果表明產(chǎn)物中含有與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的保留時(shí)間的物質(zhì)；經(jīng)質(zhì)譜進(jìn)一步確定，該物質(zhì)與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量。
　　 隨后分別對(duì)這6株菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)分析表明05a、48c和62c屬于鏈格孢屬(Alternaria)，07c屬于毛殼菌屬(Chaetomium)，31b和71a屬于擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis

3、)。之后分別提取這6株菌的基因組DNA，通過PCR方法擴(kuò)增18S rDNA，PCR產(chǎn)物均約為1.8 kb。通過對(duì)PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全一致，與相應(yīng)屬的標(biāo)準(zhǔn)株相比，其18S rDNA相似性均在97％以上。最后通過DNAMAN和ClustalW軟件對(duì)此6株菌進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)一步確定了其分類地位。
　　 最后，通過反向PCR方法和RACE(Rapid Amplification of cDNA