產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的遺傳轉(zhuǎn)化及紫杉醇合成途徑相關(guān)基因的克隆.pdf

1、上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的遺傳轉(zhuǎn)化及紫杉醇合成途徑相關(guān)基因的克隆姓名：汪業(yè)春申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐克軒20070601歲蓐震磊震摯博士學(xué)位論文生真菌發(fā)酵液提取物中檢測(cè)到了紫杉醇及其重要前體巴卡亭IⅡ。抗癌細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵液提取物能顯著抑制或殺死肝癌細(xì)胞系BEL7402。根據(jù)生理特性和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，該菌株被鑒定為雙孢束梗孢菌(Didymostilbesp)，將其命名為DFll

2、0，該菌株不同于國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。2)以本研究組以前分離到的產(chǎn)紫杉醇BT2菌株為研究材料，采用RACE技術(shù)，首次成功克隆了3羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(BT2HMGR)的全長(zhǎng)cDNA序列及其基因組序列，該基因全長(zhǎng)3926bp，含有一個(gè)3522bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)具有1173個(gè)氨基酸殘基的蛋白，序列比對(duì)結(jié)果表明，BT2HMGR基因含有四個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子；BLASTP分析顯示，該基因編碼的氨基酸與其它真菌的HM

3、GR有較高相似性。Southern雜交表明，該基因在BT2基因組中以單拷貝形式存在。RTPCR分析發(fā)現(xiàn)，BT2HMGR基因的表達(dá)受甲基茉莉酸(MeJA)誘導(dǎo)。3)成功建立了利用限制酶介導(dǎo)整合(REMI)技術(shù)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌BT2的遺傳轉(zhuǎn)化體系及檢測(cè)方法，獲得了42個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子，PCR和Southernblot分析證明外源潮霉素基因已被成功整合到B他基因組中，轉(zhuǎn)化頻率大約是56個(gè)轉(zhuǎn)化子／微克質(zhì)粒DNA。該系統(tǒng)的建立為今后利用紫杉醇合成途