魚類卵黃蛋白原的免疫功能研究.pdf

1、本論文第一部分首先從六線魚(Hexagrammos otakii)中純化得到了Vg并對其進(jìn)行了鑒定。通過DEAE-23離子交換柱層析和Sephadex G-200凝膠過濾柱層析首次從經(jīng)17β-雌二醇(E2)誘導(dǎo)的六線魚體內(nèi)純化得到了Vg，并通過二級質(zhì)譜對其進(jìn)行了鑒定；native-PAGE顯示Vg分子量約為450 kDa，SDS-PAGE顯示Vg單體分子量為160 kDa左右，推測Vg為同源三聚體；native-PAGE后的凝膠經(jīng)特異性

2、染色證明六線魚Vg也是一種富含糖、脂、磷的蛋白。 本論文第二部分通過實(shí)驗(yàn)證明了Vg是一種典型的模式識別受體，并且具有調(diào)理素功能，能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的噬菌作用。將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Vg與各種菌孵育后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Vg可以分別與E.coli，S.Aureus和P.Pastoris結(jié)合；另外通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)證明Vg可以與病原相關(guān)分子模式(PAMPs)脂多糖(LPS)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PG

3、N)、β-1，3-葡聚糖(β-1，3-gluean)和海帶多糖(laminarin)等發(fā)生特異性結(jié)合，并且結(jié)合呈現(xiàn)濃度依賴性。上述結(jié)果表明Vg是一種多價(jià)的模式識別受體。我們還研究了Vg對巨噬細(xì)胞噬菌作用的影響。實(shí)驗(yàn)表明Vg可以明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬。硬骨魚的頭腎在功能和結(jié)構(gòu)上被認(rèn)為與哺乳動(dòng)物的骨髓相當(dāng)，其含有大量的巨噬細(xì)胞。我們利用Percoll密度梯度離心法分離得到六線魚頭腎巨噬細(xì)胞，通過吞噬實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)兩個(gè)參數(shù)--吞噬能力(PA)

4、和吞噬指數(shù)(PI)評價(jià)巨噬細(xì)胞的噬菌水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照相比，經(jīng)Vg處理的實(shí)驗(yàn)組的PA和PI都有顯著性高(p＜0.05)，說明Vg能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞的噬菌作用；另外還發(fā)現(xiàn)FITC標(biāo)記的Vg可以與巨噬細(xì)胞表面特異性結(jié)合。上述結(jié)果表面Vg可能具有類似調(diào)理素的功能。 本論文第三部分主要對Vg的殺菌機(jī)制和Vg發(fā)揮殺菌作用的活性部位進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)表明Vg是通過分別與革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的LPS和革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁上的LTA結(jié)合來發(fā)揮對

5、E.coli和S.aureus的殺菌功能，并且發(fā)現(xiàn)Vg分子肽鏈的完整性以及糖基化對于Vg發(fā)揮殺菌作用是必需的。抗菌蛋白的抗菌機(jī)制有多種，大多數(shù)蛋白是通過與細(xì)菌細(xì)胞膜作用，而也有一些蛋白是通過與細(xì)菌細(xì)胞壁上的特定成分結(jié)合直接破壞細(xì)胞壁引起細(xì)菌溶脹破裂。為闡明Vg的殺菌機(jī)制，首先我們通過掃描電鏡技術(shù)和細(xì)菌/原生質(zhì)體裂解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Vg能夠引起E.coli和S.aureus的裂解，但不能引起無細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的裂解，說明Vg通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁來發(fā)

6、揮對E.coli和S.aureus的殺菌作用，而并非以細(xì)胞膜為靶部位；其次通過抑菌圈實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS和LTA可以分別抑制Vg對E coli和S.Aureus的殺菌作用，這與LPS和LTA能與Vg結(jié)合結(jié)果相一致。因此上述結(jié)果可以說明Vg是通過與細(xì)菌細(xì)胞壁上的LPS或LTA結(jié)合來發(fā)揮殺菌作用的。 另外本部分對Vg發(fā)揮殺菌作用的活性部位進(jìn)行了研究。蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾對其功能作用至關(guān)重要。為鑒定Vg分子發(fā)揮殺菌作用的活性部位，我們

7、首先對Vg分別進(jìn)行了肽鏈破壞、氧化糖基、去磷酸化以及去脂等處理，將上述處理的Vg分別進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Vg脫脂和去磷酸化對其抑菌作用沒有影響，而降解其肽鏈和氧化糖基卻使Vg抑菌活性喪失。這說明Vg分子的糖蛋白部分在抑菌作用中發(fā)揮重要作用；另外發(fā)現(xiàn)Vg對E.coli的抑菌作用可以被D-甘露糖抑制，對S.Aureus的抑菌作用可以被N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-海藻糖抑制，說明Vg可能具有類凝集素的活性。 總之，本論文通過體