擬穴青蟹卵黃蛋白原及其類似物的研究.pdf

1、卵黃蛋白原(vitellogenin，Vg)廣泛存在于卵生動(dòng)物中，是卵黃磷蛋白(vitellin，Vn)的前體蛋白，而Vn則是卵黃蛋白(yolkprotein，YP)的主要成分。Vg是一種高分子量的含糖、磷、脂的蛋白，其最基本的功能是為胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量，此外Vg還具有運(yùn)輸脂類、參與免疫防御等多方面的功能。
　　本課題組先前已克隆了擬穴青蟹（Scyllaparamamosain）Vg(SpVg)的gDNA和cDNA全長(zhǎng)序列

2、，并且對(duì)SpVg進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)分析，因此本文在此基礎(chǔ)上對(duì)SpVg進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，主要結(jié)果如下:
　　1)利用三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）Vn抗體，采用westernblot方法確定了雌性擬穴青蟹Vg/Vn蛋白的亞基組成，血淋巴Vg由約80kDa和207kDa兩個(gè)亞基組成，卵巢Vn由約80kDa、100kDa和107kDa三個(gè)亞基組成。并且推測(cè)得到擬穴青蟹外源性Vg的剪切模式:約287kDa的Sp

3、Vg在肝胰腺合成后，被類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-likeendoprotease)識(shí)別RERR保守基序，剪切得到約80kDa和207kDa大小兩個(gè)亞基，它們隨后被釋放入血淋巴并被運(yùn)輸至卵巢，大亞基在卵巢中再一次被某種未知的蛋白酶剪切成約100kDa和107kDa兩個(gè)小亞基，這樣SpVg經(jīng)過兩次蛋白酶剪切最終形成含三個(gè)亞基的Vn。
　　2)采用免疫組化和原位雜交法對(duì)雌性擬穴青蟹肝胰腺和卵巢中的Vg/Vn進(jìn)行定位，結(jié)果顯

4、示卵巢的濾泡細(xì)胞和肝胰腺的腺管上皮細(xì)胞是Vg合成的場(chǎng)所。Vg蛋白最終被卵母細(xì)胞吸收，經(jīng)過一系列的剪切加工后形成Vn，儲(chǔ)存于卵黃顆粒中，為以后的胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
　　Vg通常被認(rèn)為是雌性動(dòng)物特有的蛋白，而雄性動(dòng)物通過外界誘導(dǎo)也可產(chǎn)生，但有趣的是我們竟然在正常生理?xiàng)l件下的雄性擬穴青蟹生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)Vg類似物(SpVg-like)的存在，并將其與雌蟹中的SpVg進(jìn)行比較，主要內(nèi)容如下:
　　1)用分子生物學(xué)方法在精巢組織中克

5、隆得到SpVg-like的cDNA全長(zhǎng)序列(8316bp)，并將其與從雌性青蟹中克隆得到的SpVg的gDNA和cDNA進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SpVg-likecDNA與SpVgcDNA序列基本一致，但在5'端保留了SpVggDNA的前三個(gè)內(nèi)含子，這種現(xiàn)象被稱為內(nèi)含子保留，是一種選擇性剪接。
　　2)在雄性擬穴青蟹各組織中對(duì)SpVg-likemRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果只有精巢有該基因的表達(dá)。
　　3)利用三疣梭子蟹Vn抗體，采用we

6、sternblot方法在雄性擬穴青蟹的貯精囊中檢測(cè)到了一條大小約210kDa的目的條帶，我們認(rèn)為它就是SpVg-like蛋白，并且發(fā)現(xiàn)它與雌蟹血淋巴檢測(cè)到的SpVg蛋白大亞基的大小幾乎相同，所以我們推測(cè)SpVg-like蛋白的序列可能與SpVg蛋白大亞基一致。
　　4)采用免疫組化和原位雜交法在擬穴青蟹的精巢、貯精囊和納精囊中分別對(duì)SpVg-like蛋白和SpVg-likemRNA進(jìn)行定位。結(jié)果SpVg-like蛋白在這三個(gè)組織中