大豆黃酮對(duì)雞肝臟卵黃蛋白原基因表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本研究以產(chǎn)蛋后期肉種母雞和海蘭雞胚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用體內(nèi)和體外相結(jié)合的研究方法，探討大豆黃酮對(duì)雞肝臟卵黃蛋白原(vitellogenin，VTG)基因表達(dá)的影響及機(jī)制。 1、大豆黃酮對(duì)產(chǎn)蛋后期母雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及肝臟中VTG mRNA表達(dá)的影響本實(shí)驗(yàn)以換羽后第二次產(chǎn)蛋后期(67周齡)的肉種母雞(矮腳B)為動(dòng)物模型，研究大豆黃酮對(duì)其產(chǎn)蛋性能與肝臟中VTG mRNA表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)選取肉種母雞480只，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(C)飼喂

2、基礎(chǔ)日糧，實(shí)驗(yàn)組(Da)在基礎(chǔ)日糧中添喂10mg/kg的大豆黃酮，每組設(shè)8個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)周期為8周，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間采取自由飲水，溫控在22±1℃，光照為每天15小時(shí)。每天記錄各組的產(chǎn)蛋數(shù)，在第5周時(shí)，收集后三天的種蛋，每組隨機(jī)抽取30枚種蛋作蛋品質(zhì)分析。在第6周末，每組隨機(jī)選取10只母雞宰殺后采樣，收集血清、肝臟、卵巢、卵泡、產(chǎn)道等組織樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：添喂10 mg/kg大豆黃酮后的母雞，前兩周產(chǎn)蛋率顯著上升(p<0.05)，且整

3、個(gè)實(shí)驗(yàn)期間一直維持高產(chǎn)蛋率。蛋品質(zhì)的分析結(jié)果表明：兩組間種蛋平均重量無(wú)顯著差異(60.67±0.75g vs 59.56±0.68g)；種蛋的蛋殼厚度(0.32±0.01mm vs 0.35±0.01mm)和蛋殼比重(12.12±0.13％ vs 12.57±0.15％)顯著增加，與對(duì)照組相比，分別增加了0.03mm和0.45％(p<0.01和p<0.05)；蛋殼強(qiáng)度有所增加(13.0±0.3 kg/cm<'2> vs 13.4±0.5

4、kg/cm<'2>)，但未達(dá)到顯著性水平(p>0.05)；大豆黃酮組種蛋的破蛋率顯著降低，但兩組間畸形蛋比率無(wú)顯著差異(p>0.05)；種蛋的Haugh單位(80.98±1.13)顯著提高，比對(duì)照組種蛋的Haugh單位(76.98±1.33)提高了4.0個(gè)單位(p<0.05)；蛋黃重、蛋清重、蛋黃顏色等指標(biāo)均無(wú)顯著性變化(p>0.05)。添喂大豆黃酮第六周后屠宰母雞，采樣記錄結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，大豆黃酮組母雞的體重、卵巢內(nèi)大卵泡數(shù)、

5、產(chǎn)道重量均無(wú)顯著性變化(p>0.05)。此外，采用RT-PCR方法，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)母雞肝臟中VTG mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明：飼喂大豆黃酮6周后，對(duì)產(chǎn)蛋母雞肝臟中VTG mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響(p>0.05)。 2、大豆黃酮對(duì)肝細(xì)胞中VTG mRNA及雌激素受體mRNA表達(dá)的影響為了避免體內(nèi)多種因素的影響，我們進(jìn)一步采用體外分離培養(yǎng)雞胚肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，采用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)探討大豆黃酮對(duì)VTG mRNA表達(dá)的影響。

6、 從15胚齡的海蘭雞胚中分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，首先采用含5％的胎牛血清培養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)肝細(xì)胞，為了去除血清因素的影響，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)后，撤去培養(yǎng)液，采用無(wú)血清的ITs培養(yǎng)基(培養(yǎng)液中添加10μg/mL，胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10<'-8>mol/L亞硒酸鈉)，同時(shí)添加大豆黃酮、17 β-estradiol(E<,2>)、tamoxifen(TAM)，以及在不同的雌激素背景下，添加不同劑量的大豆黃酮和/或tamoxifen

7、，處理48小時(shí)后收集細(xì)胞提取總RNA。采用RT-PCR方法，以β-actin為內(nèi)標(biāo)檢測(cè)大豆黃酮對(duì)肝細(xì)胞VTG mRNA及雌激素受體(ERα和ERβ)mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明：100μM大豆黃酮在體外無(wú)血清培養(yǎng)的條件下，能誘導(dǎo)肝細(xì)胞中VTG mRNA的表達(dá)；在不同的E<,2>的背景下，大豆黃酮的效應(yīng)存在差異，在1μM E<,2>的背景下，100μM的大豆黃酮促進(jìn)肝細(xì)胞中VTG mRNA表達(dá)，且表現(xiàn)出與雌激素的協(xié)同效應(yīng)；而在此條件下，添

8、加1μM和10μM的大豆黃酮對(duì)肝細(xì)胞VTG mRNA表達(dá)無(wú)顯著性影響(p>0.05)；在10μM E<,2>的背景下，大豆黃酮表現(xiàn)出抗雌激素效應(yīng)，且具有劑量依賴性。當(dāng)添加10μM的選擇性雌激素阻斷劑-tamoxifen后，VTG mRNA的表達(dá)受到顯著性抑制(p<0.05)。無(wú)論培養(yǎng)液中是否添加雌激素，100μM的大豆黃酮對(duì)ERα mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著的影響，而同時(shí)添加10μM TAM可顯著上調(diào)ERα mRNA的表達(dá)，僅10μM TA

9、M也可顯著上調(diào)ERαmRNA的表達(dá)(p>0.05)。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大豆黃酮可以顯著上調(diào)ERβ mRNA的表達(dá)(p<0.05)，且TAM可以阻斷大豆黃酮上調(diào)ERβ基因的表達(dá)，而當(dāng)在有雌激素背景下，ERβ mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，添加大豆黃酮和/或TAM不能進(jìn)一步影響ERβ mRNA的表達(dá)(p>0.05)。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大豆黃酮可以顯著提高產(chǎn)蛋后期母雞的產(chǎn)蛋性能，提高蛋殼厚度和蛋的新鮮度。在低雌激素背景下，一定劑量的