單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組測序及比較基因組學(xué)分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)為兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性菌,能夠感染人類并引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等臨床癥狀,死亡率高達20%-30%,同時也能感染40多種動物,其中反芻動物為易感宿主,感染后死亡率為20%-100%,因此,LM是一種重要的食源性人獸共患病原菌。食品污染導(dǎo)致的李斯特菌病暴發(fā)疫情在歐美國家時有發(fā)生,在美國是引發(fā)食物中毒致死的第三大“元兇”。然而,對這些引起李斯特菌病暴發(fā)或散

2、發(fā)菌株的內(nèi)在聯(lián)系及差異本質(zhì)認識不足或知之甚少,而不斷發(fā)展的全基因組測序技術(shù)能夠更全面、精細地分析基因組的堿基序列,對于解讀其所包含的遺傳信息和揭示LM的致病機制提供了強有力的技術(shù)支持。在后基因組時代,可以通過比較基因組學(xué)分析的方法來詮釋這些生物學(xué)特征的遺傳信息。因此,本研究分別對我國兩株高毒力羊臨床LM分離株XYSN與NTSN進行了全基因組測序和注釋分析,并利用生物信息學(xué)軟件進行比較基因組學(xué)分析,從而對基因組的遺傳結(jié)構(gòu)、毒力相關(guān)因子和系

3、統(tǒng)發(fā)育進化有了更為全面深入的理解。在此基礎(chǔ)之上,通過同源重組技術(shù)對XYSN中的基因組島9(genomic island9,GI9)進行敲除,并探究其與XYSN高致病力之間的聯(lián)系。這些研究結(jié)果為LM的致病機制及李斯特菌病的預(yù)防和控制提供了更可靠的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
  1.動物源分離株XYSN和NTSN的生物學(xué)特性研究
  對動物源分離株XYSN和NTSN進行了生物學(xué)特性的相關(guān)研究。傳統(tǒng)生化反應(yīng)管結(jié)果顯示XYSN不確定,而全

4、自動微生物生化鑒定系統(tǒng)結(jié)果為單核細胞增生李斯特菌,而NTSN生化鑒定結(jié)果均為單核細胞增生李斯特菌。借助多重PCR及LM診斷血清對分離株的血清型進行鑒定結(jié)果顯示,XYSN血清型尚不明確(4b或4e),而NTSN血清型為4b。藥敏實驗結(jié)果提示,XYSN和NTSN對多種抗生素均表現(xiàn)敏感。對Caco-2細胞侵襲試驗結(jié)果表明,XYSN和NTSN侵襲Caco-2細胞的侵襲率分別為11.5%和6.35%,分別比國際標準株EGD-e(侵襲率為1.53%

5、)高8倍和4倍,表明其具有較高的侵襲力。對BALB/c小鼠的LD50實驗測定中,XYSN的LD50為103.10CFU,毒力比強毒株EGD-e強400倍,為迄今為止發(fā)現(xiàn)毒力最強的LM分離株,而NTSN的LD50為105.46 CFU,毒力與EGD-e相當,屬于強毒菌株。
  此外,基于管家基因的MLST分型結(jié)果顯示,XYSN和NTSN的ST型分別為626和1,其中ST1屬于克隆復(fù)合群(Clonal Complex,CC) CC1,

6、而ST626為新申請的ST型。而基于毒力基因actA的遺傳譜系進化分析結(jié)果表明,XYSN位于譜系Ⅰ和Ⅱ之間,但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系更近一些,表明其進化過程的特殊性。而NTSN為典型譜系Ⅰ菌株,其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)處于同一進化位置,暗示其可能屬于高侵襲性流行克隆。
  2.單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN的全基因組測定及注釋分析
  單核細胞增生李斯特

7、菌XYSN是迄今發(fā)現(xiàn)的毒力最高的山羊臨床分離株。通過Roche454和Sanger法測序技術(shù),完成了XYSN的全基因組測序和補缺口(Gap closing)工作。全基因組注釋分析結(jié)果顯示,XYSN基因組全長2,994,702 bp,GC含量為37.95%,編碼2933個蛋白預(yù)測基因,編碼區(qū)占整個基因組的88.3%,蛋白平均長度為300個氨基酸,含有67個tRNA以及18個rRNA(16S、23S和5S rRNA各6個)。在基因組和基因注

8、釋的基礎(chǔ)上,運用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析出1個CPRISPR、9個基因組島、5個前噬菌體、14對雙組份調(diào)控元件以及一個單獨的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因以及19個內(nèi)化素。與其他LM菌株相比,XYSN的內(nèi)化素數(shù)量差異較大,存在inlD、inlK、inlE、inlF和inlI等內(nèi)化素基因缺失,也存在5個特異的內(nèi)化素基因,其中i-inlF、i-inlE和LMxysn_2611均來自伊氏李斯特菌,i-inlF和i-inlE存

9、在于基因組島9中,而LMxysn_2611存在于前噬菌體5中。
  單核細胞增生李斯特菌NTSN是具有強毒力和潛在暴發(fā)流行特點的綿羊臨床分離株。與XYSN采用的測序方法一樣,我們完成了NTSN全基因組序列的測定。全基因組注釋分析結(jié)果顯示,NTSN基因組全長2,904,500 bp,GC含量為38.0%,編碼2821個蛋白預(yù)測基因,編碼區(qū)占整個基因組的88.9%,蛋白平均長度為304個氨基酸,含有67個tRNA以及18個rRNA(1

10、6S、23S和5S rRNA各6個)。NTSN基因組中含有1個基因組島、1個前噬菌體、14對雙組份調(diào)控元件以及一個單獨的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因和26個內(nèi)化素。其中,NTSN中內(nèi)化素的組成和分布與譜系Ⅰ的4b血清型LM菌株極其相似。
  3.單核細胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比較基因組學(xué)分析和進化分析
  在XYSN比較基因組學(xué)分析中,首先選擇國際標準株EGD-e和F2365作為參考菌株,基因組共線性分析顯示

11、XYSN與EGD-e和F2365之間基因組的共線性很好,只有2個共線性模塊(Locally colinear blocks,LCBs)?;蚪M間并未存在翻轉(zhuǎn)、易位等基因組重排現(xiàn)象,但存在缺失或插入,這與氨基酸水平的比對分值比(BLAST score ratio,BSR)分析結(jié)果一致。此外,選取測序菌株XYSN在內(nèi)的15個LM菌株的全基因組,進行LM泛基因組構(gòu)建與分析結(jié)果表明,LM作為一種較保守且穩(wěn)定的物種,具有開放型的泛基因組,能夠容納

12、較低程度的水平基因轉(zhuǎn)移。綜合比較BSR分析和泛基因組分析結(jié)果顯示,XYSN基因組中的特異基因主要為假定蛋白以及一些編碼轉(zhuǎn)座酶和整合酶的基因,其中部分基因存在于5個前噬菌體和9個基因組島中。對XYSN進行潛在毒力基因分析,共挖掘出102個潛在毒力相關(guān)基因,并系統(tǒng)深入地總結(jié)了LM不同功能分類的毒力相關(guān)基因。此外,毒力相關(guān)基因比較分析顯示,XYSN基因組中存在毒力基因缺失、其他屬特有毒力基因獲得以及共有毒力基因突變的現(xiàn)象,暗示這些差異可能與其

13、高致病力相關(guān)。同時,基因突變、缺失和水平基因轉(zhuǎn)移可推動XYSN進化過程。
  在NTSN比較基因組學(xué)分析中,選擇譜系Ⅰ、4b血清型的標準株F2365與LL195作為參考菌株,基因組共線性結(jié)果顯示,NTSN與F2365和LL195之間基因組的共線性極高,僅有1個LCBs,說明基因組序列非常地保守。進一步分析表明,NTSN與F2365高度同源,同源性為99.9%,提示其具有相似的流行特征,但仍含有195個SNPs以及34處插入和缺失,

14、暗示這些因素可能造成生物學(xué)特征的微小差異。
  在進化分析中,基于MVLST分型毒力基因、MLST分型管家基因和基于全基因組中818個核心同源基因的進化分析結(jié)果均顯示,XYSN處于兩大進化分支譜系Ⅰ和Ⅱ之間,但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系較近,表明其進化過程的特殊性。而NTSN屬于典型的譜系I菌株,其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株(F2365、LL195、J1816和Clip80459)處于同一進化位置,顯示它們是由同一祖先進化而來,且N

15、TSN亦具有引起人李斯特菌病暴發(fā)的潛在可能。
  4.單核細胞增生李斯特菌XYSN中基因組島9缺失突變株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)特性研究
  利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了單核細胞增生李斯特菌XYSN中GI9的缺失突變株。利用PCR擴增出XYSN基因組中GI9的上下游同源臂片段之后,采用SOEing PCR方法將上下游同源臂拼接起來,并將拼接片段與pMD20-T載體相連后測序鑒定。測序正確的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切回收后插入載體pAULA中,獲

16、得的重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入XYSN感受態(tài)細胞中。在溫度和紅霉素抗性雙重選擇壓力下傳16代后發(fā)生同源重組,然后將質(zhì)粒脫去PCR測序鑒定后,最終獲得GI9缺失的菌株XYSNAGI9。
  在獲得缺失突變株XYSNΔGI9基礎(chǔ)上,我們對GI9的生物學(xué)特性進行了探究。缺失突變株與其親本株的生長曲線、生理生化特性和對藥物的敏感性均無顯著差異,表明GI9對生長代謝的影響作用不明顯。卵磷脂酶實驗中XYSN和XYSNAGI9菌落周圍均出現(xiàn)透明圈,說

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