單核細(xì)胞增生李斯特菌XYSN和NTSN全基因組測(cè)序及比較基因組學(xué)分析.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）為兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陽性菌，能夠感染人類并引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)等臨床癥狀，死亡率高達(dá)20％-30％，同時(shí)也能感染40多種動(dòng)物，其中反芻動(dòng)物為易感宿主，感染后死亡率為20％-100％，因此，LM是一種重要的食源性人獸共患病原菌。食品污染導(dǎo)致的李斯特菌病暴發(fā)疫情在歐美國(guó)家時(shí)有發(fā)生，在美國(guó)是引發(fā)食物中毒致死的第三大“元兇”。然而，對(duì)這些引起李斯特菌病暴發(fā)或散

2、發(fā)菌株的內(nèi)在聯(lián)系及差異本質(zhì)認(rèn)識(shí)不足或知之甚少，而不斷發(fā)展的全基因組測(cè)序技術(shù)能夠更全面、精細(xì)地分析基因組的堿基序列，對(duì)于解讀其所包含的遺傳信息和揭示LM的致病機(jī)制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。在后基因組時(shí)代，可以通過比較基因組學(xué)分析的方法來詮釋這些生物學(xué)特征的遺傳信息。因此，本研究分別對(duì)我國(guó)兩株高毒力羊臨床LM分離株XYSN與NTSN進(jìn)行了全基因組測(cè)序和注釋分析，并利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，從而對(duì)基因組的遺傳結(jié)構(gòu)、毒力相關(guān)因子和系

3、統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化有了更為全面深入的理解。在此基礎(chǔ)之上，通過同源重組技術(shù)對(duì)XYSN中的基因組島9(genomic island9，GI9)進(jìn)行敲除，并探究其與XYSN高致病力之間的聯(lián)系。這些研究結(jié)果為L(zhǎng)M的致病機(jī)制及李斯特菌病的預(yù)防和控制提供了更可靠的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　1.動(dòng)物源分離株XYSN和NTSN的生物學(xué)特性研究
　　對(duì)動(dòng)物源分離株XYSN和NTSN進(jìn)行了生物學(xué)特性的相關(guān)研究。傳統(tǒng)生化反應(yīng)管結(jié)果顯示XYSN不確定，而全

4、自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特菌，而NTSN生化鑒定結(jié)果均為單核細(xì)胞增生李斯特菌。借助多重PCR及LM診斷血清對(duì)分離株的血清型進(jìn)行鑒定結(jié)果顯示，XYSN血清型尚不明確（4b或4e），而NTSN血清型為4b。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，XYSN和NTSN對(duì)多種抗生素均表現(xiàn)敏感。對(duì)Caco-2細(xì)胞侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，XYSN和NTSN侵襲Caco-2細(xì)胞的侵襲率分別為11.5％和6.35％，分別比國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e（侵襲率為1.53％

5、）高8倍和4倍，表明其具有較高的侵襲力。對(duì)BALB/c小鼠的LD50實(shí)驗(yàn)測(cè)定中，XYSN的LD50為103.10CFU，毒力比強(qiáng)毒株EGD-e強(qiáng)400倍，為迄今為止發(fā)現(xiàn)毒力最強(qiáng)的LM分離株，而NTSN的LD50為105.46 CFU，毒力與EGD-e相當(dāng)，屬于強(qiáng)毒菌株。
　　此外，基于管家基因的MLST分型結(jié)果顯示，XYSN和NTSN的ST型分別為626和1，其中ST1屬于克隆復(fù)合群(Clonal Complex，CC) CC1，

6、而ST626為新申請(qǐng)的ST型。而基于毒力基因actA的遺傳譜系進(jìn)化分析結(jié)果表明，XYSN位于譜系Ⅰ和Ⅱ之間，但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系更近一些，表明其進(jìn)化過程的特殊性。而NTSN為典型譜系Ⅰ菌株，其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株（F2365、LL195、J1816和Clip80459）處于同一進(jìn)化位置，暗示其可能屬于高侵襲性流行克隆。
　　2.單核細(xì)胞增生李斯特菌XYSN和NTSN的全基因組測(cè)定及注釋分析
　　單核細(xì)胞增生李斯特

7、菌XYSN是迄今發(fā)現(xiàn)的毒力最高的山羊臨床分離株。通過Roche454和Sanger法測(cè)序技術(shù)，完成了XYSN的全基因組測(cè)序和補(bǔ)缺口(Gap closing)工作。全基因組注釋分析結(jié)果顯示，XYSN基因組全長(zhǎng)2，994，702 bp，GC含量為37.95％，編碼2933個(gè)蛋白預(yù)測(cè)基因，編碼區(qū)占整個(gè)基因組的88.3％，蛋白平均長(zhǎng)度為300個(gè)氨基酸，含有67個(gè)tRNA以及18個(gè)rRNA（16S、23S和5S rRNA各6個(gè)）。在基因組和基因注

8、釋的基礎(chǔ)上，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析出1個(gè)CPRISPR、9個(gè)基因組島、5個(gè)前噬菌體、14對(duì)雙組份調(diào)控元件以及一個(gè)單獨(dú)的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅰ型和Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因以及19個(gè)內(nèi)化素。與其他LM菌株相比，XYSN的內(nèi)化素?cái)?shù)量差異較大，存在inlD、inlK、inlE、inlF和inlI等內(nèi)化素基因缺失，也存在5個(gè)特異的內(nèi)化素基因，其中i-inlF、i-inlE和LMxysn_2611均來自伊氏李斯特菌，i-inlF和i-inlE存

9、在于基因組島9中，而LMxysn_2611存在于前噬菌體5中。
　　單核細(xì)胞增生李斯特菌NTSN是具有強(qiáng)毒力和潛在暴發(fā)流行特點(diǎn)的綿羊臨床分離株。與XYSN采用的測(cè)序方法一樣，我們完成了NTSN全基因組序列的測(cè)定。全基因組注釋分析結(jié)果顯示，NTSN基因組全長(zhǎng)2，904，500 bp，GC含量為38.0％，編碼2821個(gè)蛋白預(yù)測(cè)基因，編碼區(qū)占整個(gè)基因組的88.9％，蛋白平均長(zhǎng)度為304個(gè)氨基酸，含有67個(gè)tRNA以及18個(gè)rRNA（1

10、6S、23S和5S rRNA各6個(gè)）。NTSN基因組中含有1個(gè)基因組島、1個(gè)前噬菌體、14對(duì)雙組份調(diào)控元件以及一個(gè)單獨(dú)的調(diào)節(jié)蛋白、Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)中相關(guān)基因和26個(gè)內(nèi)化素。其中，NTSN中內(nèi)化素的組成和分布與譜系Ⅰ的4b血清型LM菌株極其相似。
　　3.單核細(xì)胞增生李斯特菌XYSN和NTSN比較基因組學(xué)分析和進(jìn)化分析
　　在XYSN比較基因組學(xué)分析中，首先選擇國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株EGD-e和F2365作為參考菌株，基因組共線性分析顯示

11、XYSN與EGD-e和F2365之間基因組的共線性很好，只有2個(gè)共線性模塊(Locally colinear blocks，LCBs)?；蚪M間并未存在翻轉(zhuǎn)、易位等基因組重排現(xiàn)象，但存在缺失或插入，這與氨基酸水平的比對(duì)分值比(BLAST score ratio，BSR)分析結(jié)果一致。此外，選取測(cè)序菌株XYSN在內(nèi)的15個(gè)LM菌株的全基因組，進(jìn)行LM泛基因組構(gòu)建與分析結(jié)果表明，LM作為一種較保守且穩(wěn)定的物種，具有開放型的泛基因組，能夠容納

12、較低程度的水平基因轉(zhuǎn)移。綜合比較BSR分析和泛基因組分析結(jié)果顯示，XYSN基因組中的特異基因主要為假定蛋白以及一些編碼轉(zhuǎn)座酶和整合酶的基因，其中部分基因存在于5個(gè)前噬菌體和9個(gè)基因組島中。對(duì)XYSN進(jìn)行潛在毒力基因分析，共挖掘出102個(gè)潛在毒力相關(guān)基因，并系統(tǒng)深入地總結(jié)了LM不同功能分類的毒力相關(guān)基因。此外，毒力相關(guān)基因比較分析顯示，XYSN基因組中存在毒力基因缺失、其他屬特有毒力基因獲得以及共有毒力基因突變的現(xiàn)象，暗示這些差異可能與其

13、高致病力相關(guān)。同時(shí)，基因突變、缺失和水平基因轉(zhuǎn)移可推動(dòng)XYSN進(jìn)化過程。
　　在NTSN比較基因組學(xué)分析中，選擇譜系Ⅰ、4b血清型的標(biāo)準(zhǔn)株F2365與LL195作為參考菌株，基因組共線性結(jié)果顯示，NTSN與F2365和LL195之間基因組的共線性極高，僅有1個(gè)LCBs，說明基因組序列非常地保守。進(jìn)一步分析表明，NTSN與F2365高度同源，同源性為99.9％，提示其具有相似的流行特征，但仍含有195個(gè)SNPs以及34處插入和缺失，

14、暗示這些因素可能造成生物學(xué)特征的微小差異。
　　在進(jìn)化分析中，基于MVLST分型毒力基因、MLST分型管家基因和基于全基因組中818個(gè)核心同源基因的進(jìn)化分析結(jié)果均顯示，XYSN處于兩大進(jìn)化分支譜系Ⅰ和Ⅱ之間，但與譜系Ⅱ的菌株親緣關(guān)系較近，表明其進(jìn)化過程的特殊性。而NTSN屬于典型的譜系I菌株，其與造成人李斯特菌病暴發(fā)的菌株（F2365、LL195、J1816和Clip80459）處于同一進(jìn)化位置，顯示它們是由同一祖先進(jìn)化而來，且N

15、TSN亦具有引起人李斯特菌病暴發(fā)的潛在可能。
　　4.單核細(xì)胞增生李斯特菌XYSN中基因組島9缺失突變株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)特性研究
　　利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了單核細(xì)胞增生李斯特菌XYSN中GI9的缺失突變株。利用PCR擴(kuò)增出XYSN基因組中GI9的上下游同源臂片段之后，采用SOEing PCR方法將上下游同源臂拼接起來，并將拼接片段與pMD20-T載體相連后測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切回收后插入載體pAULA中，獲

16、得的重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入XYSN感受態(tài)細(xì)胞中。在溫度和紅霉素抗性雙重選擇壓力下傳16代后發(fā)生同源重組，然后將質(zhì)粒脫去PCR測(cè)序鑒定后，最終獲得GI9缺失的菌株XYSNAGI9。
　　在獲得缺失突變株XYSNΔGI9基礎(chǔ)上，我們對(duì)GI9的生物學(xué)特性進(jìn)行了探究。缺失突變株與其親本株的生長(zhǎng)曲線、生理生化特性和對(duì)藥物的敏感性均無顯著差異，表明GI9對(duì)生長(zhǎng)代謝的影響作用不明顯。卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)中XYSN和XYSNAGI9菌落周圍均出現(xiàn)透明圈，說