豬肺炎支原體和豬鼻支原體的基因組測序與比較基因組學分析.pdf

1、支原體是一類缺少細胞壁的原核微生物，宿主范圍十分廣泛，具有高接觸性、高傳染性和高發(fā)病率的特性，而且對常用的作用于細胞壁的抗生素（如β-內(nèi)酰胺酶類抗生素等）不敏感，因此臨床控制十分困難。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化程度越來越高，國際貿(mào)易日趨頻繁，動物支原體的危害也逐漸顯現(xiàn)，并且形勢越來越嚴峻。由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)引起的豬氣喘病是嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病?，F(xiàn)已證實，豬肺炎支原體感染導致

2、豬呼吸道纖毛損傷、脫落，從而引起肺炎。由于缺乏有效的遺傳操作工具，人們對豬肺炎支原體致病機制方面的研究還相對滯后。目前，豬肺炎支原體毒力因子的研究主要集中在粘附因子方面，其中P97蛋白是最早被證實具有粘附作用的粘附因子，隨后為數(shù)不多的粘附因子如P102、P146、P159和P216等相繼報道，豬肺炎支原體是否存在其他與致病相關的毒力因子尚不明確。本研究以具有明晰進化歷程的豬肺炎支原體168親本株和疫苗株為切入點，通過系統(tǒng)的比較基因組學分

3、析，從核苷酸堿基序列差異、整合性結合元件、引起基因組全長差異的因素、代謝途徑差異以及氨基酸水平上的差異對粘附因子、被膜蛋白、蛋白分泌系統(tǒng)、免疫原性蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白的影響等方面，開展了豬肺炎支原體在實驗室連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中毒力減弱的分子機制研究，為闡明豬肺炎支原體的致病機制提供理論依據(jù)。豬鼻支原體和豬肺炎支原體都被劃分為豬支原體病的病原，但豬鼻支原體卻表現(xiàn)出多樣的寄生方式，具有侵染實驗室多種細胞（來源于不同物種）的能力。豬肺炎支原體專性定植

4、于呼吸道，而豬鼻支原體能定位于機體中多種組織，能在多種疾病的污染物中分離得到，而且有報道指出豬鼻支原體的長期感染能夠誘導癌癥的發(fā)生。相對于豬肺炎支原體，豬鼻支原體表現(xiàn)出了多樣的生活方式，從基因組學層面剖析豬鼻支原體多樣的生活方式會加深人們對豬鼻支原體的了解。本課題主要研究內(nèi)容包括:
　　1.豬肺炎支原體、豬鼻支原體的全基因組測序與生物信息學分析
　　采用SolexaGenomeAnalyzerⅡx、RocheGSFLX和AB

5、I3730測序系統(tǒng)相結合的優(yōu)化方案，分別對豬肺炎支原體168親本株和疫苗株、豬鼻支原體HUB-1株的全基因組序列進行了測定，并利用Multiplex-PCR和ABISequencing方法填補基因組序列空缺。在完成了全基因組序列的測定后，通過基因組ORFs的預測、編碼區(qū)起點終點的校正、基因注釋、功能基因分類、IS序列等分析，最終繪制了基因組完成圖，其中HUB-1株的全基因組序列是國際上測定并公布在GenBank上的第一株豬鼻支原體全基因

6、組序列。
　　根據(jù)豬肺炎支原體的基因組信息，開展了基因組共線性分析、IS插入元件分析、膜相關蛋白分析和代謝分析，發(fā)掘了與病原菌生長、代謝相關的基因，重建了豬肺炎支原體的代謝通路，一共包括八大代謝門類，依次分別是核苷酸代謝、糖代謝、聚糖的生物合成和代謝、其它氨基酸的代謝、脂質(zhì)代謝、輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝和能量代謝。進一步分析發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體的碳源和能量主要來源于糖酵解途徑，而在分析糖酵解途徑時，豬肺炎支原體不能利用淀粉蔗糖代

7、謝產(chǎn)生的α-D-Glucose-1P，其碳源幾乎全部來源于外源葡萄糖的攝取。
　　2.豬肺炎支原體親本株、疫苗株的比較基因組學分析
　　比較基因組學的分析主要從核苷酸堿基序列差異、整合性結合元件、引起基因組全長差異的因素、代謝途徑差異和氨基酸水平上的差異對粘附因子、被膜蛋白、蛋白分泌系統(tǒng)、免疫原性蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白的影響等方面展開。豬肺炎支原體168親本株和疫苗株基因組全長分別為925576bp和921093bp，兩菌株基因組中

8、基因的組成和順序高度保守。通過對核苷酸堿基序列差異的系統(tǒng)分析，最終挖掘到了330個遺傳變異位點（其中包括227個SNVs，60個插入和43個缺失）。有意義的是，目前國際上已報道的豬肺炎支原體毒力相關基因（如:P97，P102，P146，P159，P216等）和主要免疫原性基因（如:P36，P46，P65等）幾乎全部包含在這330個遺傳變異位點內(nèi)。深入分析后發(fā)現(xiàn)，P97中的氨基酸突變發(fā)生在串聯(lián)重復的短肽序列AAKPV/E中，而AAKPV/

9、E功能域被證明與P97的粘附能力密切相關。P146中的谷氨酰胺的插入發(fā)生在[Q]n[(P/S)Q]m串聯(lián)重復區(qū)，脯氨酸和谷氨酰胺富集區(qū)會形成polyprolineⅡhelix的螺旋結構，這一螺旋結構在粘附過程中也十分重要。P216中四個氨基酸(polyQ)的缺失位于polyQ的重復區(qū)域，polyQ功能域在維持P216C端P85片段定位于細胞表面起著十分重要的作用，而P85具有粘附能力。P159中的錯義突變發(fā)生在(S)(S)G(G)S重復

10、區(qū)域中。
　　進一步從氨基酸水平上分析了遺傳變異對轉(zhuǎn)運蛋白的影響。支原體擁有最低程度的新陳代謝以及最小的基因組冗余，為了適應寄生生活，支原體丟失了許多與代謝相關的基因，其營養(yǎng)物質(zhì)的補給大部分來源于對外源物質(zhì)的攝取。與此對應，支原體需要許多轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，豬肺炎支原體有兩套轉(zhuǎn)運系統(tǒng):一種是磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS);一種是ABCtransporter轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在168親本株傳代過程中并沒有受到影響。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中MHP168

11、L_394(ABCtransporterpermeaseprotein)和MHP168L_413(ATP-bindingprotein)發(fā)生了突變，而它們在Mhp體內(nèi)感染過程中的表達量相對于體外生長時是上調(diào)的，提示MHP168L_394和MHP168L_413在豬肺炎支原體感染的過程中發(fā)揮著某種作用，轉(zhuǎn)運蛋白的突變很可能影響支原體在宿主細胞內(nèi)的生存和增殖。對168親本株和疫苗株的代謝途徑進行了差異分析，經(jīng)鑒定差異基因主要分布在7條代謝通

12、路中，依次分別為糖酵解途徑、嘌呤代謝途徑、嘧啶代謝途徑、甘油磷脂代謝途徑、氨酰基tRNA生物合成途徑以及磷酸戊糖途徑。綜上所述，似乎正是這些遺傳變異在粘附、免疫、代謝等功能基因中不斷地積累，造成了基因功能的改變，最終導致了菌株毒力的差異。
　　3.支原體比較基因組學分析
　　以支原體科20株支原體的完整基因組序列為研究材料，首先通過BLAST方法進行基因預測、Inparanoid程序?qū)ふ抑毕低椿驅(qū)Γ⒉捎肨ribeMCL

13、方法完成了20株支原體直系同源群的聚類化分析。隨后進行了核心基因組學分析，確定了整個支原體科的核心基因。結合核心基因組與已報道的隨機轉(zhuǎn)座突變實驗結果，系統(tǒng)分析了支原體賴以生存所必須的保守基因，指出在隨機轉(zhuǎn)座實驗中干擾掉的recA、recU、uvrA、uvrB、mutM等基因可能在支原體野外的長期生存中是必須的，而它們在轉(zhuǎn)座實驗后短暫的生存能力可能是因為其對IS元件插入的暫時性耐受。通過對核心基因組和豬鼻支原體蛋白功能聚類的比較分析，發(fā)現(xiàn)

14、支原體中與氨基酸合成、糖類運輸和防御功能相關的蛋白急劇減少，指出了支原體在進化過程中功能基因丟失的趨勢。將支原體的196個核心基因分別比對，并將比對結果串聯(lián)，根據(jù)串聯(lián)基因的比對結果，使用Tree-puzzle，在GTR+gamma+(Ⅰ)模型下進行最大相似度擬合，計算支原體菌株間的距離矩陣，最終繪制了支原體科的超級進化樹。在進化樹的基礎上，用Branch-Site方法評估了各分支上支原體在進化過程中自然選擇壓力的分布情況，發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體