食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其檢驗(yàn)

1、,第三節(jié) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及其檢驗(yàn)主要內(nèi)容：一、生物學(xué)特性二、流行病學(xué)三、檢驗(yàn)四、控制,第八章 食品中其它致病菌的檢驗(yàn),李斯特氏菌屬,李斯特氏菌屬包括七個種： 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 、綿羊李斯特氏菌 、英諾克李斯特氏菌 、威爾斯李斯特氏菌 、西爾李斯特氏菌 、格氏李斯特氏菌 、默氏李斯特氏菌。 其中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌對人類致病性強(qiáng)，綿羊李斯特氏菌對人類也有一定的致病性，其余李斯特氏菌無致病性。,單核細(xì)胞增生李斯

2、特氏菌,單核細(xì)胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。 它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表現(xiàn)為敗血癥、 腦膜炎和單核細(xì)胞增多。 它廣泛存在于自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中，必須加以重視。,全身傳染,毒血癥：病原菌在入侵的局部生長繁殖，細(xì)菌不侵入血流，只是其產(chǎn)生的毒素侵入血流引起全身性狀．白喉、破傷

3、風(fēng)菌血癥：病原菌入侵機(jī)體后進(jìn)入血流，但不在血流中繁殖，如傷寒、流行性腦脊髓膜炎的早期有菌血癥期.膿毒血癥:病原性球菌引起的敗血癥.由于病原菌隨血流播散,在全身多種組織或臟器(肝肺腎皮下等)引起多發(fā)性化膿病灶.如金黃葡萄球菌導(dǎo)致的膿毒血癥.敗血癥:是球菌、桿菌等侵入血液中并在其中生長繁殖產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物所引起的急性全身性感染。癥狀是寒戰(zhàn)、高熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大，部分有感染性休克和遷徙性病灶。,一、生物學(xué)特性,1、形態(tài)與染

4、色革蘭氏陽性短桿菌，大小為0.4~0.5×0.5~2µm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，多數(shù)菌體一端較大，似棒狀，細(xì)胞常呈V字形排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀。20-25℃以4根周生鞭毛運(yùn)動，在37℃只有較少的鞭毛或1根鞭毛；無芽孢。在血清葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖莢膜。,一、生物學(xué)特性,2、培養(yǎng)特性 該菌營養(yǎng)要求不高，在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2－5天可見傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡

5、下可見翻跟斗運(yùn)動。 該菌的生長范圍為2--42℃（也有報道在0℃能緩慢生長），最適培養(yǎng)溫度為35--37℃，在pH中性至弱堿性（pH9.6）、氧分壓略低、二氧化碳張力略高的條件下該菌生長良好，在pH3.8－4.4能緩慢生長，在6.5% NaCl 肉湯中生長良好。,產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌在半固體培養(yǎng)基中的生長情況,有動力自穿刺線向四周蔓延生長呈典型傘狀生長，底部為彎月牙狀,一、生物學(xué)特性,2、培養(yǎng)特性在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明

6、，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。,Listeria monocytogenes,血平板,單核增生李斯特氏菌 ATCC 1911736h，35℃培養(yǎng),血平板,無害李斯特氏菌 ATCC 33

7、09036h，35℃培養(yǎng),血平板,伊氏李斯特氏菌 ATCC 1911924h，35℃培養(yǎng),一、生物學(xué)特性,3、生化反應(yīng)觸酶陽性，氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖（遲發(fā)酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解。吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽還原、賴氨酸、鳥氨酸均陰

8、性。VP、甲基紅試驗(yàn)和精氨酸水解陽性。,一、生物學(xué)特性,觸酶試驗(yàn),,3、生化反應(yīng) 過氧化氫酶，又稱接觸酶，能催 化過氧化氫水解為氫和氧,右為陰性左為陽性,一、生物學(xué)特性,葡萄糖：陽性,糖酵解試驗(yàn),一、生物學(xué)特性,麥芽糖 陽性,對照,一、生物學(xué)特性,七葉苷 陽性,一、生物學(xué)特性,鼠李糖 陽性,甘露醇陰性,一、生物學(xué)特性,一、生物學(xué)特性,木糖陰性,木糖陰性,一、生物學(xué)特性,,尿素酶試驗(yàn)：有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解，產(chǎn)生兩個分

9、子的氨，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。穿刺接種尿素瓊脂斜面，35℃培養(yǎng)5天，逐日觀察陰性,尿素酶試驗(yàn),,1 未接種2 尿素酶陽性3尿素酶陰性,一、生物學(xué)特性,硝酸鹽還原試驗(yàn)：接種硝酸鹽肉湯，35℃培養(yǎng)5天，加入0.2ml的試劑A,再加入0.2ml的試劑B,輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者表明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。若無顏色變化，須加入少量鋅粉變紅者為陰性（硝酸鹽未被還原）不變?yōu)殛栃裕▉喯跛猁}已

10、分解成氨和氮）,硝酸鹽還原試驗(yàn),甲基紅實(shí)驗(yàn),V-P試驗(yàn),一、生物學(xué)特性,4、血清型根據(jù)菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a,1/2b,1/2c,3a,3c,3c,4a,4b;4ab,4c,4d,4e和“7”13個血清型。致病菌株的血清型一般1/2b,1/2c,3a,3b,3c,4a,1/2a,4b,后兩型居多。,一、生物學(xué)特性,該菌對理化因素的抵抗力較強(qiáng)，在土壤、糞便、青貯飼料和干草內(nèi)能長期存

11、活。對堿和鹽的抵抗力較強(qiáng)，60-70℃20-30min即被殺死；70%的酒精5min，2.5%的氫氧化鈉、2.5%的石炭酸、2.5%的福爾馬林20min即可殺死此菌。該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、磺胺均敏感。,二、流行病學(xué),單增李氏菌廣泛存在于自然界中，不易被凍融，能耐受較高的滲透壓，在土壤、污水、地表水、廢水、植物、青貯飼料、爛菜中均有該菌存在，所以，動物很容易誤食該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播。李氏菌是條件致病菌，大多

12、為散發(fā)病例，也可因污染食品而爆發(fā)。本菌能產(chǎn)生一種溶血性質(zhì)的外毒素，能引起人、牛、綿羊等動物的腦膜炎，可使家兔、豚鼠等實(shí)驗(yàn)動物感染引起血中單核細(xì)胞增高。可引起嬰兒及新生兒的化膿性腦膜炎或腦膜腦炎，死亡率可達(dá)70%，子宮內(nèi)感染的胎兒，可導(dǎo)致流產(chǎn)、習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎或新生兒李斯特氏菌病。,二、流行病學(xué),與李斯特氏菌有關(guān)的食品肉制品（熱狗、香腸）軟奶酪鮮奶生菜色拉,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),1、樣品的采集: 冷凍樣品：2

13、-5 ℃解凍，不超過18小時。若不能及時檢驗(yàn)，應(yīng)置于-15 ℃保存 非冷凍易腐樣品：應(yīng)盡可能及時檢驗(yàn)，若不能及時檢驗(yàn)，應(yīng)置于4 ℃冰箱保存，在24小時之內(nèi)檢驗(yàn)。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),2、樣品的處理: 以無菌操作采取樣品25ml(g)置于滅菌均質(zhì)器中,加入225ml的EB和LB增菌液,充分?jǐn)嚢杈鶆?如不能及時檢驗(yàn),可保存在4℃冰箱中.3、增菌培養(yǎng) EB增菌液放入(30+-1)℃溫箱中培養(yǎng)48h-7d.LB

14、1增菌液放入(30+-1)℃溫箱中培養(yǎng)24h,取出0.1ml加入10ml的LB2增菌液中2次增菌.,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),4、分離培養(yǎng)將EB增菌液和LB2增菌液分別畫線接種于MMA選擇性培養(yǎng)基瓊脂平板上,置(30+-1)℃培養(yǎng)48h小時,挑選可疑菌落,用白熾燈45度角斜光照射平板,該菌的菌落為灰藍(lán)或蘭色小圓形菌落.選擇MMA平板上5個以上的可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和SIM動力培養(yǎng)基,培養(yǎng)于(25+-1) ℃,觀察是否有動力,

15、且傘狀或月牙狀生長.一般觀察,陽性者作下一步實(shí)驗(yàn).,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),三糖鐵（TSI）瓊脂試驗(yàn),SIM動力試驗(yàn),,接種三糖鐵瓊脂，35℃培養(yǎng)5天。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),5 、純培養(yǎng) 將上述有動力、傘狀，并在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上層下層產(chǎn)酸而不產(chǎn)硫化氫的可疑菌落接種于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（YSA-YE）上，做純培養(yǎng)，供做證實(shí)試驗(yàn)鑒定用．,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、染色鏡檢：從YSA-YE平板上挑取可

16、疑純培養(yǎng)物做革蘭氏染色并做濕片查．該菌為陽性無芽孢桿菌；用生理鹽水制成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現(xiàn)輕微旋轉(zhuǎn)或翻滾樣運(yùn)動．,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),革蘭氏染色陽性,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、生化試驗(yàn)：將上述可疑菌落做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，該菌的生化特征及種間區(qū)別如下：+為陽性；-為陰性；√為有反應(yīng),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、生化試驗(yàn)溶血試驗(yàn)：7%羊血瓊脂平板，劃分小格，刺種

17、菌落。做陽性對照和陰性對照（英諾克李斯特氏菌）。35℃培養(yǎng)24-48小時，于明亮處觀察。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在刺種點(diǎn)產(chǎn)生窄小的透明β溶血環(huán)。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、生化試驗(yàn) MR-VP試驗(yàn)：接種MR-VP肉湯，35 ℃培養(yǎng)48小時。移取1ml于潔凈試管，加入5%的α-萘酚 溶液6ml,再加入10%的KOH溶液0.2ml, 輕搖1min,靜置20min. V-P

18、陽性反應(yīng)：紅色。 剩余培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2d, 加入甲基紅指示劑5滴。 MR陽性反應(yīng)：紅色。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、生化試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn) 接種0.5%的糖類發(fā)酵管。35℃培養(yǎng)24-48h，陰性繼續(xù)培養(yǎng)到5天。李斯特氏菌不產(chǎn)氣。 單增李斯特氏菌生化反應(yīng)如下： 葡萄糖：陽性 麥芽糖：陽性 七葉苷：陽性 甘露醇：陰性 鼠李糖：陽性 木糖：陰性,三、單核細(xì)胞增生李斯特

19、氏菌檢驗(yàn),葡萄糖：陽性,6、生化試驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),鼠李糖 陽性,6、生化試驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),木糖陰性,6、生化試驗(yàn),甘露醇陰性,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),6、生化試驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),七葉苷 陽性,6、生化試驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),麥芽糖 陽性,6、生化試驗(yàn),三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),7、小鼠毒力試驗(yàn) 將符合生化試驗(yàn)的純培養(yǎng)物接種于TSB-YE中，在30℃

20、培養(yǎng)24h，離心、濃縮，使?jié)饪s液含細(xì)菌量1010個/ml,取0.5ml濃縮液注射小白鼠腹腔（3-5只），觀察小白鼠的死亡情況。致病菌株于2-5d內(nèi)死亡，同時應(yīng)做已知菌對照試驗(yàn)。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌對小白鼠有致病性。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),8、協(xié)同溶血試驗(yàn)（CAMP) 在血平板上平行接種金黃葡萄球菌和馬紅球菌，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，在30 ℃培養(yǎng)24-48h,檢查平板中垂直接

21、種點(diǎn)對溶血環(huán)的影響?？拷瘘S葡萄球菌接種點(diǎn)的單增李斯特氏菌的溶血增強(qiáng)，西爾斯李氏菌的溶血也增強(qiáng)，綿羊李氏菌在馬紅球菌附近的溶血也增強(qiáng)，有助于鑒別。,三、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn),結(jié)果報告： 陽性結(jié)果：檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 陰性結(jié)果：未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌,四、控制,單增李斯特氏菌在一般熱加工處理中能存活，熱處理已殺滅了競爭性細(xì)菌群，使單增李斯特氏菌在沒有競爭的環(huán)境條件下易于存活，所以在食品加工中，中心溫度必須達(dá)到70℃