hBMP2與hVEGF165雙基因共表達腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs復合n-HA-PA66組織工程骨構(gòu)建及檢測.pdf

1、背景:組織工程骨由種子細胞、外源生長因子、支架材料三部分構(gòu)成。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)被認為是良好的種子細胞，其在骨修復應用方面已顯示出良好的效果;在骨缺損修復中有多種細胞生長因子參與，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenetic protein2，BMP2）被認為是誘導成骨分化作用的關(guān)鍵生物活性物質(zhì)，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族的一員，它參與調(diào)節(jié)

2、細胞增殖、種系分化、細胞死亡等一系列的生物過程;血管內(nèi)皮生長因子165(Vascularendothelia growth factor165，VEGF165)在血管再生和骨組織再生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究證實，納米羥基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66，n-HA/PA66)具有良好的生物力學性、生物安全性和相容性，臨床工作中已將其作為修復支架材料開始應用。然而單獨應用n-HA/PA

3、66修復骨缺損尚存在缺陷和不足。因此，選擇細胞生長因子表達載體轉(zhuǎn)染BMSCs獲得持續(xù)、高效表達外源生長因子，以克服外源性生長因子在體內(nèi)易充散、效價低、時效短等問題。
　　初期動物實驗表明，BMP2和VEGF165蛋白質(zhì)在骨缺損修復中獲得良好的治療效果。我們此次實驗基于之前的研究，通過基因工程構(gòu)建腺病毒Ad-BMP2-VEGF165，轉(zhuǎn)染BMSCs復合n-HA/PA66，檢測hBMP2和hVEGF165目的基因的表達及成骨細胞分化的

4、活動，旨在為體外組織工程骨構(gòu)建提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，同時為課題后期動物體內(nèi)骨缺損修復實驗奠定良好的細胞學基礎(chǔ)。
　　目的:
　　1.骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定，獲得良好的組織工程骨種子細胞。
　　2.hBMP2與hVEGF165雙基因共表達腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，獲得高效、持續(xù)外源生長因子表達載體。
　　3.體外hBMP2與hVEGF165雙基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs復合n-HA/PA66，構(gòu)建及檢測

5、組織工程骨生物學表達，為組織工程骨體內(nèi)成骨研究提供分子生物學的方面技術(shù)支持和理論依據(jù)，同時為課題后期動物體內(nèi)骨缺損修復實驗奠定好細胞學基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用密度梯度離心法分離BMSCs，倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs的大體形態(tài)，成骨細胞誘導培養(yǎng)21d后，茜素紅染色觀察細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)生成情況;取第3代BMSCs進行細胞表型鑒定。
　　2.通過PCR方法從cDNA文庫中擴增BMP2和VEGF165基因，連接到腺病毒

6、穿梭質(zhì)粒pAd-MCMV-GFP的多克隆位點上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAd-MCMV-BMP2-VEGF165。然后再與腺病毒輔助質(zhì)粒pBHGlox△(delta) E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝重組腺病毒Ad-BMP2-VEGF165，經(jīng)HEK293細胞擴增純化后測定病毒滴度。將重組腺病毒轉(zhuǎn)染預先凍存的BMSCs，不同時間點觀察目的基因蛋白表達。
　　3.取第3代BMSCs作為細胞實驗對象，實驗共分2組:Ad-BMP2-V

7、EGF165為實驗組和Ad-GFP為對照組;首先用不同感染復數(shù)轉(zhuǎn)染BMSCs，并進行ELISA和Westem blot檢測細胞hBMP2和hVEGF165的表達;其次將轉(zhuǎn)染后的細胞接種到n-HA/PA66生物材料上，7d后掃描電鏡觀察細胞貼附、生長狀況;同時，7d后消化收集貼附n-HA/PA66上的細胞，Westem blot檢測貼附生物材料細胞中骨鈣素(Osteocalcin，OC)和骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)的表達。

8、
　　結(jié)果:
　　1.密度梯度離心法獲得乳白色單個核細胞層，分離得到BMSCs，24 h后倒置顯微鏡下觀察，少許細胞開始貼壁生長，散在分布，呈小梭形或多邊形;48h后首次換液，隨培養(yǎng)時間延長，細胞呈梭形，集落逐漸增大，呈漩渦狀或人字狀排列，原代細胞6-8 d即可達到80％融合，傳代后細胞呈梭形，形態(tài)大小較一致。BMSCs成骨誘導培養(yǎng)后茜素紅染色可見桔紅色鈣結(jié)節(jié)形成;第3代細胞表面高表達CD29(99.82％)和CD44(94

9、.14％)，低表達CD14(3.11％)和CD34(0.34％)。
　　2.基因測序、菌落PCR、Western blot、GFP表達均觀察證實重組腺病毒載體Ad-BMP2-VEGF165構(gòu)建成功，滴度達1×1010PFU/ml。Ad-BMP2-VEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs后，培養(yǎng)液中BMP2與VEGF165及Ad-BMP2組中BMP2在3-28 d均有表達，但是3-5 d時蛋白表達量最高，且與其他時間點相比均有統(tǒng)計學意義，5d以

10、后蛋白表達量逐漸減少，具有時間依賴性。
　　3.腺病毒轉(zhuǎn)染后hBMP2和hVEGF165蛋白水平高表達;掃描電鏡見轉(zhuǎn)染細胞分布均勻，生長狀態(tài)良好。實驗組與對照組相比，復合n-HA/PA66后Western Blot檢測顯示OC和OPN表達均較高，兩組差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.BMSCs分離、培養(yǎng)及鑒定成功，早代細胞具有較強的增殖能力，可作為良好的種子細胞用于后續(xù)實驗。
　　2.攜帶