裝載經RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒載體的絲素多孔支架及其促血管化作用.pdf

1、加快皮膚真皮再生支架的血管化速度，是提高支架的成活率、有效引導真皮再生、修復全層皮膚缺損的關鍵問題。VEGF165和Ang-1是兩種重要的促血管生長因子，聯(lián)合作用既有利于促進血管的生成，又可以使新生血管獲得穩(wěn)定的結構。本文將RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒載體裝載在多孔絲素支架內，研究RGD修飾的VEGF165和Ang-1雙基因共表達腺病毒對EA.hy926細胞的感染效率；研究裝載基因載體的生物活性絲素支架體外對

2、血管內皮細胞的感染以及對雞胚尿囊膜血管生成的促進作用。進一步，將裝載基因載體的絲素支架移植于大鼠的皮膚真皮缺損部位，研究支架內目的基因的原位感染和表達，及其對血管生成、真皮再生的影響。
　　首先，用pAd.VEGF165-Ang-1和腺病毒骨架質粒pAd.RGD同源重組得到同源重組質粒pAd.RGD-VEGF165-Ang-1，將線性化的pAd.RGD-VEGF165-Ang-1通過Lipofectamine2000轉染到QBI-

3、293A包裝細胞中得到重組腺病毒Ad.RGD-VEGF165-Ang-1。用感染復數分別為10、20、30、40、50、100、150的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞儀檢測結果表明，隨著感染復數的增大，熒光表達增強，感染效率增大，當感染復數為50時，感染效率達到81％。
　　其次，用感染復數為50的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926細胞，培

4、養(yǎng)1，3，5，7天。CCK-8檢測結果表明Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染細胞有助于促進EA.hy926細胞的增殖。ELISA檢測VEGF和Ang-1因子分泌水平，結果表明感染Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的細胞分泌的VEGF165和Ang-1的量顯著高于未感染對照組（p<0.05），且在7天內，隨著時間的延長，這兩種生長因子的分泌量增大。將Ad.RGD-VEGF165-Ang-1裝載在絲素多孔支架內，掃描電鏡觀察

5、結果表明腺病毒顆粒均勻的分布在支架內的孔壁上。在裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架內接種細胞，熒光顯微鏡觀察絲素多孔支架內的腺病毒能夠感染接種的細胞，說明裝在絲素支架上的腺病毒能保持感染細胞的活性。將接種細胞的絲素支架用戊二醛固定，掃描電鏡觀察細胞在絲素支架內的生長情況，可見細胞在支架表面能夠充分鋪展、增殖。雞胚尿囊膜實驗觀察結果表明，裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架具有良好的促血管化的

6、能力。
　　進一步，將裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架植入 SD大鼠的皮膚真皮缺損部位。HE和Masson’s染色進行的組織學觀察結果說明，與未裝載病毒載體的支架相比，裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的多孔絲素支架移植于SD大鼠的全層皮膚缺損創(chuàng)面后，能顯著促進支架內部微血管的生成，促進膠原纖維產生，促進真皮組織再生。免疫組化結果表明裝載Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的絲素多孔支架移植