雙基因共表達的Tet-on載體的構(gòu)建和檢測.pdf

1、Tet-on系統(tǒng)是一種基于四環(huán)素操縱子（tetracycline operaon）的可調(diào)控基因表達系統(tǒng)，當四環(huán)素（tetracycline，Tet）衍生物強力霉素（doxcycline，Dox）不存在時，反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子（reverse tetracycline-controlled transactivator，rtTA）不能識別四環(huán)素操縱基因（Tet Operator，TetO），目的基因不表達；當有Dox存在時，rtTA才可

2、與TetO結(jié)合啟動基因的轉(zhuǎn)錄。本研究主要利用FMDV來源的2A序列和EMCV來源的IRES序列兩種共表達元件，對Tet-on表達系統(tǒng)進行改造，構(gòu)建了兩個單質(zhì)粒單啟動子的雙報告基因Tet-on表達載體，利用紅色熒光蛋白dsredl和增強型綠色熒光蛋白egfp兩種報告基因進行誘導倍數(shù)的定量檢測。根據(jù)Real-time PCR定量結(jié)果和鏡檢結(jié)果，經(jīng)過改造以后的兩個表達系統(tǒng)不加入誘導劑時的本底水平均比原來的pTRE AutoR3更低，并且得到較

3、為良好的誘導倍數(shù)；兩種不同改造策略得到的共表達Tet-on載體中，pTRE DsRedl-IRES-EGFP AutoR3比pTRE DsRed1-2A-EGFPAutoR3本底更低，誘導效率更高。通過改造得到的這種單質(zhì)粒單啟動子的雙報告基因Tet-on表達載體既能夠?qū)崿F(xiàn)四環(huán)素調(diào)控又能借助共表達方式以報告基因EGFP的熒光強度作為上游基因表達量的直觀檢測手段，將來把上游報告基因dsredl替換成功能基因時，就既能由強力霉素調(diào)控外源基因表