雙基因共表達(dá)的Tet-on載體的構(gòu)建和檢測(cè).pdf

1、Tet-on系統(tǒng)是一種基于四環(huán)素操縱子（tetracycline operaon）的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)四環(huán)素（tetracycline，Tet）衍生物強(qiáng)力霉素（doxcycline，Dox）不存在時(shí)，反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子（reverse tetracycline-controlled transactivator，rtTA）不能識(shí)別四環(huán)素操縱基因（Tet Operator，TetO），目的基因不表達(dá)；當(dāng)有Dox存在時(shí)，rtTA才可

2、與TetO結(jié)合啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。本研究主要利用FMDV來(lái)源的2A序列和EMCV來(lái)源的IRES序列兩種共表達(dá)元件，對(duì)Tet-on表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，構(gòu)建了兩個(gè)單質(zhì)粒單啟動(dòng)子的雙報(bào)告基因Tet-on表達(dá)載體，利用紅色熒光蛋白dsredl和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白egfp兩種報(bào)告基因進(jìn)行誘導(dǎo)倍數(shù)的定量檢測(cè)。根據(jù)Real-time PCR定量結(jié)果和鏡檢結(jié)果，經(jīng)過(guò)改造以后的兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)不加入誘導(dǎo)劑時(shí)的本底水平均比原來(lái)的pTRE AutoR3更低，并且得到較

3、為良好的誘導(dǎo)倍數(shù)；兩種不同改造策略得到的共表達(dá)Tet-on載體中，pTRE DsRedl-IRES-EGFP AutoR3比pTRE DsRed1-2A-EGFPAutoR3本底更低，誘導(dǎo)效率更高。通過(guò)改造得到的這種單質(zhì)粒單啟動(dòng)子的雙報(bào)告基因Tet-on表達(dá)載體既能夠?qū)崿F(xiàn)四環(huán)素調(diào)控又能借助共表達(dá)方式以報(bào)告基因EGFP的熒光強(qiáng)度作為上游基因表達(dá)量的直觀檢測(cè)手段，將來(lái)把上游報(bào)告基因dsredl替換成功能基因時(shí)，就既能由強(qiáng)力霉素調(diào)控外源基因表