熱損傷后大鼠表皮干細(xì)胞中HSP90的表達(dá)研究.pdf

1、目的：分離、純化和培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，EpSCs），利用P2~P3代細(xì)胞建立熱損傷模型，檢測(cè)不同溫度熱損傷后細(xì)胞中HSP90的表達(dá)變化，探討HSP90對(duì)熱損傷后EpSCs轉(zhuǎn)歸模型的作用。
　　方法：剝離SD大鼠皮膚組織，采用“胰蛋白酶兩步消化+Ⅳ型膠原差速貼壁10min”法分離和純化大鼠EpSCs，用K-SFM培養(yǎng)基（keratinocyte serum-free medium）培養(yǎng)細(xì)胞。

2、顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以評(píng)價(jià)細(xì)胞的克隆形成能力和增殖能力。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物β1-integrin、K19和K10的表達(dá)情況，鑒定細(xì)胞表型并觀察EpSCs的純度。
　　選擇狀態(tài)良好的2-3代EpSCs作為熱損傷實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，以37℃作為對(duì)照組，分別以41℃、43℃、45℃、48℃、51℃、53℃和55℃作為實(shí)驗(yàn)組的處理溫度，在水浴鍋中孵育10min。利用

3、Hoechst33342和碘化丙啶（PI)共染，測(cè)定熱損傷后EpSCs的凋亡率和存活率;利用RT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)熱損傷后EpSCs中HSP90基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：顯微鏡下觀察所培養(yǎng)的細(xì)胞體積小、核質(zhì)比大，細(xì)胞膜折光性強(qiáng)，細(xì)胞為不規(guī)則多角形，呈集落樣生長(zhǎng)，鏡下可見(jiàn)典型的鋪路石狀結(jié)構(gòu)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和生長(zhǎng)曲線表明，所培養(yǎng)的細(xì)胞在體外具有較強(qiáng)的克隆形成能力和增殖能力。細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)所培

4、養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)干性標(biāo)識(shí)β1-integrin和K19，不表達(dá)分化標(biāo)識(shí)K10，顯示了所培養(yǎng)的細(xì)胞純度較高。
　　Hoechst33342和PI共染結(jié)果顯示：與37℃對(duì)照組相比，在41℃~51℃之間，熱損傷后EpSCs的凋亡率和死亡率隨著溫度的升高而遞增，51℃達(dá)到細(xì)胞凋亡高峰，55℃細(xì)胞死亡率最高。RT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致顯示：37℃對(duì)照組中HSP90表達(dá)量相對(duì)偏低；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中HSP90表達(dá)變化明顯，在

5、41℃～48℃熱刺激條件下，細(xì)胞中HSP90的表達(dá)量逐漸增加，其中45℃和48℃組中的表達(dá)量大致在同一水平；超過(guò)48℃后，HSP90表達(dá)水平逐漸下降。
　　結(jié)論：所培養(yǎng)的細(xì)胞符合EpSCs生物學(xué)特征和表型，成功建立了SD大鼠表皮干細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)方法；在一定溫度范圍內(nèi)，熱應(yīng)激后的EpSCs中 HSP90的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)，HSP90可能參與EpSCs的熱應(yīng)激反應(yīng)并發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用；48℃下熱損傷細(xì)胞10min，為建