熱損傷后大鼠表皮干細胞中HSP90的表達研究.pdf

1、目的：分離、純化和培養(yǎng)大鼠表皮干細胞（Epidermal stem cells，EpSCs），利用P2~P3代細胞建立熱損傷模型，檢測不同溫度熱損傷后細胞中HSP90的表達變化，探討HSP90對熱損傷后EpSCs轉歸模型的作用。
　　方法：剝離SD大鼠皮膚組織，采用“胰蛋白酶兩步消化+Ⅳ型膠原差速貼壁10min”法分離和純化大鼠EpSCs，用K-SFM培養(yǎng)基（keratinocyte serum-free medium）培養(yǎng)細胞。

2、顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，通過克隆形成實驗和生長曲線，計算細胞克隆形成率，繪制細胞生長曲線，以評價細胞的克隆形成能力和增殖能力。利用免疫熒光技術檢測細胞表面標志物β1-integrin、K19和K10的表達情況，鑒定細胞表型并觀察EpSCs的純度。
　　選擇狀態(tài)良好的2-3代EpSCs作為熱損傷實驗細胞，以37℃作為對照組，分別以41℃、43℃、45℃、48℃、51℃、53℃和55℃作為實驗組的處理溫度，在水浴鍋中孵育10min。利用

3、Hoechst33342和碘化丙啶（PI)共染，測定熱損傷后EpSCs的凋亡率和存活率;利用RT-PCR及Western Blot實驗方法檢測熱損傷后EpSCs中HSP90基因轉錄及蛋白質表達情況。
　　結果：顯微鏡下觀察所培養(yǎng)的細胞體積小、核質比大，細胞膜折光性強，細胞為不規(guī)則多角形，呈集落樣生長，鏡下可見典型的鋪路石狀結構?？寺⌒纬蓪嶒灪蜕L曲線表明，所培養(yǎng)的細胞在體外具有較強的克隆形成能力和增殖能力。細胞免疫熒光技術檢測所培

4、養(yǎng)的細胞表達干性標識β1-integrin和K19，不表達分化標識K10，顯示了所培養(yǎng)的細胞純度較高。
　　Hoechst33342和PI共染結果顯示：與37℃對照組相比，在41℃~51℃之間，熱損傷后EpSCs的凋亡率和死亡率隨著溫度的升高而遞增，51℃達到細胞凋亡高峰，55℃細胞死亡率最高。RT-PCR及Western Blot實驗檢測結果一致顯示：37℃對照組中HSP90表達量相對偏低；實驗組細胞中HSP90表達變化明顯，在

5、41℃～48℃熱刺激條件下，細胞中HSP90的表達量逐漸增加，其中45℃和48℃組中的表達量大致在同一水平；超過48℃后，HSP90表達水平逐漸下降。
　　結論：所培養(yǎng)的細胞符合EpSCs生物學特征和表型，成功建立了SD大鼠表皮干細胞分離、純化和培養(yǎng)方法；在一定溫度范圍內，熱應激后的EpSCs中 HSP90的基因轉錄及蛋白質表達水平上調，HSP90可能參與EpSCs的熱應激反應并發(fā)揮細胞保護作用；48℃下熱損傷細胞10min，為建