氧化應(yīng)激后Hsp90對(duì)大鼠VSMC中p-ERK1-2的作用.pdf

1、目的：觀察氧化應(yīng)激后Hsp90作為分子伴侶對(duì)大鼠VSMCp-ERK1/2作用，以及它對(duì)CyPA和CAV-1與p-ERK1/2相互作用的影響。 方法：為觀察氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)Hsp90蛋白表達(dá)變化及ERK1/2的活化，實(shí)驗(yàn)取培養(yǎng)的4～10代大鼠VSMC，用1цMLY83583處理不同時(shí)間(control，5min，10min，30min，60min，90min，120min，180min)，收集細(xì)胞總蛋白，用WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Hsp90

2、，ERK1/2和p-ERK1/2。為觀察Hsp90是否可以作為分子伴侶對(duì)p-ERK1/2作用，實(shí)驗(yàn)分為4組：control(PBS處理120min)、LY(1цMLY83583處理120min)、Gel+DMSO+LY(先用5цMLY83583預(yù)處理30min，再用1цMLY83583處理120min)、DMSO+LY(先用10-6DMSO預(yù)處理30min，再用1цMLY83583處理120min)，收集細(xì)胞總蛋白，用Hsp90一抗免疫

3、沉淀，WB檢測(cè)p-ERK1/2；再分別收集細(xì)胞總蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白和核蛋白，WB直接檢測(cè)p-ERK1/2的變化；免疫熒光檢測(cè)4組細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)p-ERK1/2的變化。實(shí)驗(yàn)還用WB檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)CyPA和CAV-1在LY83583處理不同時(shí)間后蛋白表達(dá)的變化；p-ERK1/2的一抗免疫沉淀control、LY、Gel+DMSO+LY、DMSO+LY4組細(xì)胞總蛋白，以觀察CyPA和CAV-1在氧化應(yīng)激后與p-ERK1/2的結(jié)合，以

4、及Gel阻斷Hsp90后對(duì)CyPA和CAV-1與p-ERK1/2的結(jié)合的影響。 結(jié)果：LY處理不同時(shí)間，細(xì)胞內(nèi)ERK1/2在10min和120min出現(xiàn)2個(gè)活化高峰；Hsp90的蛋白表達(dá)在該時(shí)段內(nèi)逐漸增加。免疫沉淀結(jié)果顯示LY組和DMSO+LY組Hsp90與p-ERK1/2結(jié)合增加，Gel+DMSO+LY組二者無明顯結(jié)合。WB結(jié)果顯示細(xì)胞總p-ERK1/2、可溶性和細(xì)胞核內(nèi)p-ERK1/2LY組和DMSO+LY組較control

5、組增加，Gel+DMSO+LY組較control組無明顯變化；細(xì)胞不溶性蛋白LY組和DMSO+LY組較control組p-ERK1/2減少，Gel+DMSO+LY組p-ERK1/2較control組無明顯變化。免疫熒光結(jié)果顯示LY組和DMSO+LY組細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2增加，有明顯的核聚集現(xiàn)象，Gel+DMSO+LY組p-ERK1/2較對(duì)照組無明顯變化?！　?shí)驗(yàn)還檢測(cè)了氧化應(yīng)激后細(xì)胞內(nèi)CyPA和CAV-1的蛋白表達(dá)，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

6、在0～120min內(nèi)CyPA蛋白表達(dá)逐漸增加，CAV-1在10min和120min則出現(xiàn)2個(gè)表達(dá)的低峰。免疫沉淀發(fā)現(xiàn)control組和Gel+DMSO+LY組CyPA與p-ERK1/2無明顯結(jié)合，而LY組和DMSO+LY組CyPA與p-ERK1/2結(jié)合明顯增加；另外，control組和Gel+DMSO+LY組CAV-1與p-ERK1/2結(jié)合，LY組和DMSO+LY組CAV-1與p-ERK1/2結(jié)合減少。 結(jié)論： 1、Hs