自噬標(biāo)志物ATG5與LC3在腎癌組織中的表達(dá)及其對(duì)腎癌耐藥性的影響研究.pdf

1、目的：
　　腎透明細(xì)胞癌約占成人惡性腫瘤的2％～3％，截止2016年的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)顯示腎癌仍是我國(guó)發(fā)病率約第10位的惡性腫瘤，為成人腎臟惡性腫瘤的主要部分。近些年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上漲趨向，全球每年約有10萬(wàn)人死于腎癌，腎癌分布總體上發(fā)病年齡可見(jiàn)于各年齡段，高發(fā)年齡為50～70歲，最近流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示男性腎癌發(fā)病率略多于女性，地區(qū)差異也比較明顯，城市稍高于農(nóng)村。目前腎癌因缺乏早期特異性的診斷方法導(dǎo)致大部分患者診斷時(shí)腫瘤已發(fā)展至中晚

2、期。盡管現(xiàn)在對(duì)腎癌的認(rèn)識(shí)有了很大的進(jìn)步，診療手段也日益增多，但由于腎癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未明確，故腎癌目前仍以手術(shù)治療為主，術(shù)后患者生存率仍不太理想。目前，還沒(méi)有公認(rèn)的可用于臨床診斷腎癌的腫瘤標(biāo)志物。腎癌的術(shù)前診斷主要依靠腹部影像學(xué)檢查，然而，因影像學(xué)診斷的限制，腹部CT一般只能發(fā)現(xiàn)直徑大于5mm以上的腎癌，并且確診還需病理學(xué)檢查。因此，探索腎癌可能發(fā)生發(fā)展及耐藥的分子機(jī)制對(duì)腎癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。
　　目前研究已證明

3、，細(xì)胞自噬主要有三種存在形式，包括大自噬(macroautophagy，MA)、分子伴侶自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)和小自噬(microautophagy)。大自噬(macroautophagy，MA)即通常所說(shuō)的自噬，是使用雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)短效周期蛋白形成自噬泡，并且與次級(jí)溶酶體（溶酶體）融合后，在溶酶體內(nèi)酸性蛋白降解酶的作用下進(jìn)行降解再利用。一般在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)

4、短期內(nèi)（4-6小時(shí)）可以達(dá)到高峰。對(duì)于小自噬目前研究相對(duì)較少，主要是指是通過(guò)溶酶體直接與目的蛋白進(jìn)行融合后降解。
　　近來(lái)研宄發(fā)現(xiàn)，自噬可以通過(guò)代謝自身蛋白質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)逃避外界應(yīng)激，以此來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并促進(jìn)細(xì)胞存活，新近發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞往往通過(guò)自噬來(lái)增強(qiáng)其對(duì)抗癌藥物的耐藥性，以此逃避腫瘤藥物的殺傷作用。自噬相關(guān)基因5(ATG5)作為常用自噬檢測(cè)關(guān)鍵基因之一，其表達(dá)水平與自噬明顯相關(guān)。微管相干蛋白1輕鏈3(LC3)是目前研究最多的自噬

5、標(biāo)志性基因之一，其共同參與自噬體的形成，是自噬特異的常用診斷標(biāo)志物之一。目前，自噬的檢測(cè)方法主要包括免疫組織化學(xué)中檢測(cè)自噬體的形成、western blot檢測(cè)LC3。細(xì)胞增殖情況常用的檢測(cè)技術(shù)包括MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等。目前，自噬在腎癌中尤其是其耐藥性的研究尚不深入，本研究采用免疫組織化學(xué)染色、慢病毒感染、Western Blot、MTT、流式細(xì)胞術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，從分子和細(xì)胞水平，觀察了大自噬在體外腎癌細(xì)胞增殖及舒尼替尼耐藥性

6、中的作用及其分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　一、ATG5、LC3在腎透明細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與腎透明細(xì)胞癌的分級(jí)及預(yù)后相關(guān)
　　1.對(duì)99例腎癌組織和17例癌旁組織進(jìn)行免疫組化染色分析發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，ATG5和LC3在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)量明顯升高。臨床病理資料統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，ATG5和LC3的表達(dá)高低與年齡、性別、腫瘤部位無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與腎癌腫瘤惡性程度、TNM分期密切相關(guān);隨著病理學(xué)分級(jí)和TNM臨床分期的增加

7、，ATG5和LC3的表達(dá)依次升高。并且，ATG5高表達(dá)患者生存率較低，預(yù)后較差。
　　二、大自噬促進(jìn)A-498腎癌細(xì)胞株增殖
　　1.通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的ATG5shRNA表達(dá)載體感染構(gòu)建低表達(dá)的A-498腎癌細(xì)胞株，并使用Western Blot相關(guān)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，成功構(gòu)建了ATG5低表達(dá)腎癌細(xì)胞株;
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATG5正常表達(dá)與低表達(dá)組中A-498細(xì)胞增殖的變化;
　　3.7天MTT增殖曲線結(jié)果顯示，敲

8、低A-498腎透明細(xì)胞癌株中ATG5表達(dá)，能顯著降低腎癌細(xì)胞的增殖能力。
　　4.采用H2O2刺激及細(xì)胞活力檢測(cè)證明，在氧應(yīng)激情況下，敲低A-498腎癌細(xì)胞株中ATG5表達(dá)，能顯著降低腎癌細(xì)胞的存活率。
　　三、抑制自噬能降低腎癌細(xì)胞對(duì)舒尼替尼的耐藥性
　　通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATG5敲低的A-498腎癌細(xì)胞對(duì)舒尼替尼藥物的耐藥性增加。
　　結(jié)論:
　　自噬可通過(guò)抑制ATG5介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路來(lái)刺激腎癌細(xì)胞