著絲粒蛋白H在腎癌中的表達(dá)和對(duì)腎癌進(jìn)展的影響.pdf

1、腎細(xì)胞癌，即腎癌，是一種常見(jiàn)的泌尿系惡性腫瘤，因此，深入研究和探討與腎癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，對(duì)加強(qiáng)和促進(jìn)腎癌的防治工作具有重要意義。
　　著絲粒復(fù)合體作為有絲分裂過(guò)程中形成的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分，其參與和調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，使其正常精細(xì)的進(jìn)行，著絲粒蛋白功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致CIN和異倍體細(xì)胞的形成。著絲粒蛋白是一個(gè)裝配在染色體DNA上的一個(gè)大型多蛋白復(fù)合體。它給紡錘絲牽拉染色體提供附著點(diǎn)?，F(xiàn)已有百種以上著絲粒蛋白家族成員被相繼發(fā)現(xiàn)。它們?cè)?/p>

2、腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也愈受重視。一些著絲粒蛋白家族的常見(jiàn)成員，如CENPA、CENPF、CENPH和INCENP等被發(fā)現(xiàn)和多種腫瘤的病理生理過(guò)程密切相關(guān)。盡管它們?cè)谀I癌中也表現(xiàn)出表達(dá)的異常，但其在腎癌中的作用我們得知尚少。
　　著絲粒蛋白H(centromere protein H，CENPH)作為著絲粒蛋白家族的重要一員，是活性著絲粒復(fù)合體的重要組成成分，對(duì)細(xì)胞有絲分裂的準(zhǔn)確進(jìn)行有重要的調(diào)控作用。近年來(lái)著絲粒蛋白家族在腫瘤發(fā)生發(fā)

3、展中的作用愈受重視，研究顯示CENPH在多種惡性腫瘤表達(dá)異常增高，且和患者的預(yù)后相關(guān)，但由于腫瘤的異質(zhì)性，CENPH在腎癌中是否發(fā)揮核心調(diào)控作用，尚不得為知。本論文旨在研究CENPH對(duì)腎癌發(fā)生發(fā)展的影響探討其可能的影響機(jī)制。
　　本項(xiàng)研究分為三大部分。第一部分通過(guò)分析團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行的腎癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序項(xiàng)目的腎癌與癌旁組織的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)，分析包括CENPH在內(nèi)的多種著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織中的表達(dá)情況。第二部分用qRT-PCR和免

4、疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)CENPH在腎癌中的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步研究其與腎癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，探討其作為腎癌診斷及預(yù)后指標(biāo)的可能性。第三部分通過(guò)檢測(cè)CENPH在四種腎癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，建立腎癌CENPH沉默干擾模型，研究CENPH對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　第一部分：腎癌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示著絲粒蛋白H在腎癌組織中高表達(dá)
　　目的:
　　1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示腎癌組織與癌旁正常

5、腎組織的基因表達(dá)差異譜
　　2.分析著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織與癌旁正常組織表達(dá)的差異性
　　3.分析CENPH在腎癌及其他腫瘤組織中的表達(dá)情況
　　方法:
　　1.使用Illumina HiSeqTM2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)34對(duì)腎癌及癌旁正常組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;
　　2.對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、比對(duì)、篩選，進(jìn)行GO功能顯著性富集分析和pathway顯著性富集分析，找出差異基因表達(dá)譜;
　　3.在已得到數(shù)據(jù)

6、中分析著絲粒蛋白家族成員的表達(dá)差異情況;
　　4.檢索轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及芯片數(shù)據(jù)，分析CENPH在腎癌中的表達(dá)特性。
　　結(jié)果:
　　1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得出豐富的腎癌與癌旁組織基因表達(dá)差異譜
　　通過(guò)以上34對(duì)腎癌及癌旁組織RNA-Seq測(cè)序，分析結(jié)果包括含20453個(gè)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。
　　2.多種著絲粒蛋白家族成員在腎癌組織中高表達(dá)
　　在測(cè)序結(jié)果中分析著絲粒蛋白家族的表達(dá)情況。最終測(cè)

7、序結(jié)果包括20個(gè)著絲粒蛋白基因(CENPQ、CENPJ、CENPL、CENPV、CENPB、CENPI、CENPK、CENPE、CENPP、CENPW、CENPA、CENPN、INCENP、CENPT、CENPH、CENPO、CENPBD1、CENPM、CENPF、CENPC1)的表達(dá)情況。多數(shù)基因在腎癌組織中呈高表達(dá)，其中以CENPH高表最為明顯。
　　3.CENPH在包括腎癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)增高
　　CENPH在

8、所有的34對(duì)腎癌配對(duì)樣本中表現(xiàn)為高表達(dá)，檢索GENT芯片數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CENPH在包括腎癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示多種著絲粒蛋白在腎癌組織中表達(dá)上調(diào)，其中以CENPH的高表最為明顯，其表達(dá)異?？赡芘c腎癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系。
　　第二部分：著絲粒蛋白H在腎癌組織中的表達(dá)特征及與患者預(yù)后的關(guān)系
　　目的:
　　1.檢測(cè)腎癌組織中CENPH mRNA和蛋白的表達(dá)情況
　

9、　2.分析CENPH蛋白的表達(dá)水平與腎癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系
　　3.分析CENPH蛋白的表達(dá)水平與腎癌患者預(yù)后的相關(guān)性，探討CENPH作為腎癌分子標(biāo)志物的可能性。
　　方法:
　　1.用qRT-PCR方法檢測(cè)21對(duì)腎癌組織和癌旁正常腎組織中CENPH mRNA的表達(dá)水平;
　　2.通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法在腎癌組織及癌旁正常腎組織石蠟包埋標(biāo)本中檢測(cè)CENPH蛋白的表達(dá)水平;
　　3.使用SPSS20軟

10、件，采用x2檢驗(yàn)分析CENPH蛋白表達(dá)強(qiáng)弱與腎癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系;
　　4.采用Kaplan-Meier法、Log-Rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析CENPH蛋白表達(dá)水平對(duì)腎癌患者生存預(yù)后的影響。
　　結(jié)果:
　　1.腎癌組織中CENPH的表達(dá)顯著高于癌旁正常腎組織
　　在21個(gè)腎癌患者的癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常腎皮質(zhì)組織中檢測(cè)CENPH mRNA的表達(dá)情況，qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相

11、一致，顯示CENPH在腎癌組織中高表達(dá)。
　　2.CENPH蛋白的表達(dá)水平與腎癌患者的臨床病理因素相關(guān)
　　在109例腎癌標(biāo)本中，79.8％(87/109)的腎癌組織為CENPH陽(yáng)性表達(dá)，而在癌旁正常腎皮質(zhì)組織中，僅22.0％(24/109)表現(xiàn)為CENPH陽(yáng)性表達(dá)。CENPH主要定位于細(xì)胞核，部分患者胞漿也有輕微染色。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CENPH表達(dá)與患者的腫瘤Fuhrman分級(jí)(P=0.001)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.024)及

12、臨床分期(P=0.014)密切相關(guān)，未見(jiàn)其與患者性別、年齡、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　3.CENPH的表達(dá)水平與腎癌患者的生存預(yù)后相關(guān)
　　在109例臨床腎癌標(biāo)本中，CENPH高表達(dá)的患者總生存時(shí)間較CENPH低表達(dá)的患者明顯縮短（Log-Rank檢驗(yàn)，P=0.002）。Cox回歸模型分析表明，CENPH蛋白表達(dá)水平和臨床分期是腎癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。
　　結(jié)論:
　　1.CENPH在腎癌組織中高表達(dá);

13、
　　2.CENPH有可能成為一種新的腎癌預(yù)后標(biāo)志物。
　　第三部分：著絲粒蛋白H對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)作用機(jī)制
　　目的:
　　1.研究CENPH表達(dá)水平對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響
　　2.探討CENPH調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞增殖及凋亡的相關(guān)機(jī)制
　　方法:
　　1.采用qRT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)四種腎癌細(xì)胞株和一種腎小管上皮細(xì)胞株中CENPH的表達(dá)情

14、況;
　　2.采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)建立CENPH沉默干擾的腎癌細(xì)胞株模型;
　　3.通過(guò)CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)、流式AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)觀察CENPH對(duì)腎癌細(xì)胞增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;
　　4.使用Western blotting檢測(cè)腎癌細(xì)胞經(jīng)CENPH siRNA轉(zhuǎn)染后，相關(guān)增殖、凋亡標(biāo)志蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CENPH在腎癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)

15、>　　我們檢測(cè)四種腎癌細(xì)胞株和一種腎小管上皮細(xì)胞株中CENPH mRNA和蛋白的表達(dá)水平。和腎小管上皮細(xì)胞株HK-2相比，三種腎癌細(xì)胞株(ACHN，786-0和A704)中CENPH高表達(dá)（P＜0.05），而僅在細(xì)胞株A498中未見(jiàn)CENPH高表達(dá)。
　　2.下調(diào)腎癌細(xì)胞中CENPH的表達(dá)水平導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的降低
　　在相對(duì)高表達(dá)CENPH的腎癌細(xì)胞株ACHN和786-0中轉(zhuǎn)入CENPH siRNA干擾沉默CENPH，建立

16、CENPH低表腎癌細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞體外生長(zhǎng)活力、克隆形成能力，發(fā)現(xiàn)干擾沉默CENPH能降低腎癌細(xì)胞的體外增殖能力。
　　3.CENPH調(diào)節(jié)腎癌細(xì)胞的凋亡
　　腎癌細(xì)胞株ACHN和786-0分別轉(zhuǎn)染CENPH siRNA降低CENPH的表達(dá)，兩天后使用annexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示降低表達(dá)CENPH能增加腎癌細(xì)胞的凋亡水平。
　　4.CENPH影響Ki-67和Survivin的表

17、達(dá)
　　使用Western blotting方法檢測(cè)增殖和凋亡的分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-CENPH可抑制腎癌細(xì)胞中增殖蛋白Ki-67和細(xì)胞凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.CENPH在多數(shù)腎癌細(xì)胞株中高表達(dá);
　　2.敲低腎癌細(xì)胞中的CENPH表達(dá)可以抑制細(xì)胞增殖活力，增加細(xì)胞凋亡的比例;
　　3.CENPH對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響可能是通過(guò)影響Survivin蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作