Trim72在大鼠心力衰竭中的作用及初步機(jī)制研究.pdf

1、心肌細(xì)胞纖維化會(huì)導(dǎo)致包括心力衰竭、心房顫動(dòng)、心肌缺血、甚至心源性休克等心臟疾病，嚴(yán)重危害全人類的健康。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotension aldostenone system，RAAS）與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是心肌纖維化的主要發(fā)病機(jī)制，尤其TGF-β1是目前已知的與組織纖維化的發(fā)生關(guān)系最密切的生長(zhǎng)因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、促進(jìn)細(xì)胞增殖、

2、抑制炎癥等生物學(xué)功能。Tripartite motify-containing72(Trim72)基因共有7個(gè)外顯子（又稱為MG53，Gene ID：365377），編碼477個(gè)氨基酸，蛋白分子量為53 Kd。Trim72在慢性心衰中的作用及分子機(jī)制研究仍不清楚，故本文以SD大鼠為模型，主要研究Trim72在心衰組織中的表達(dá)，對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其分子機(jī)制。
　　第一部分：基于生物信息學(xué)分析心衰中的差異表達(dá)基因<

3、br>　　目的：運(yùn)用GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)的方法分析在慢性心衰中的差異基因，參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，尋找和心衰密切相關(guān)的基因。
　　方法：本部分研究以GEO公共數(shù)據(jù)中的心衰表達(dá)譜數(shù)據(jù)為分析材料，運(yùn)用EC和TAC軟件分析心衰中差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)的方法分析差異基因參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，mRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用ClueGO插件對(duì)基因集做KEGG

4、信號(hào)通路，GeneOntology, Reactom通路等富集分析。
　　結(jié)果：在獲取表達(dá)矩陣后，使用R中Limma包分析兩兩之間的差異表達(dá)基因，共有950個(gè)差異基因，430個(gè)上調(diào)基因，520個(gè)下調(diào)基因。采用 GO富集分析950個(gè)差異表達(dá)基因的生物學(xué)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)它們顯著富集于細(xì)胞增殖(cell proliferation)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑（ECM)、細(xì)胞骨架發(fā)育、刺激應(yīng)答(response to stree)、信號(hào)調(diào)控(regula

5、tion ofsignaling)、代謝調(diào)節(jié)(regulation of metabolic process)等生物學(xué)過(guò)程。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行Pathway信號(hào)通路富集分析，Pathway生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，差異基因主要富集在TGF signaling pathway、Hippo signaling pathway、PI3k-AKT signaling pathway、Wnt signaling pathway

6、、Cytokine receptor interation signaling pathway等。
　　結(jié)論：Trim72可能在心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：Trim72在SD大鼠心衰模型中的表達(dá)
　　目的：構(gòu)建SD大鼠慢性心衰模型，研究Trim72在SD大鼠慢性心力衰竭模型心臟組織中的表達(dá)情況，初步探討Trim72在慢性心力衰竭心肌纖維化發(fā)生和進(jìn)程中的作用，為T(mén)rim72在慢性心衰中的診斷和治療提供理

7、論依據(jù)。
　　方法：我們基于生物信息學(xué)分析的結(jié)果，預(yù)測(cè)到Trim72在心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，故本部分采用腹主動(dòng)脈狹窄法誘導(dǎo)SD大鼠發(fā)生慢性心衰，采用超聲心動(dòng)、HE和Masson染色法鑒定心衰模型，運(yùn)用real-time PCR、western blot和免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測(cè)，心衰標(biāo)本和正常標(biāo)本組織中Trim72 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：采用腹主動(dòng)脈狹窄法在 SD大鼠中成功復(fù)制了慢性心力衰竭，

8、超聲心動(dòng)圖和Masson染色結(jié)果顯示，SD大鼠慢性心力衰竭模型構(gòu)建成功。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Trim72在正常 SD大鼠的心臟中低表達(dá)或不表達(dá)，在慢性心衰SD大鼠心臟中高表達(dá)。
　　結(jié)論：Trim72在慢性心衰 SD大鼠心臟中高表達(dá)，有可能成為一個(gè)慢性心衰的輔助診斷標(biāo)志物。
　　第三部分：沉默MG53對(duì)SD大鼠心肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：研究沉默Trim72的表達(dá)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，明

9、確Trim72在心肌成纖維細(xì)胞中的作用。
　　方法：采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化SD乳鼠的心臟組織，差速貼壁離心法分離心肌成纖維細(xì)胞，形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光法鑒定心肌成纖維細(xì)胞。用原代分離培養(yǎng)的CFs細(xì)胞為模型，用小干擾RNA技術(shù)沉默CFs細(xì)胞中Trim72的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為3組：空白組，陰性對(duì)照組，siRNA實(shí)驗(yàn)組。siRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后，RealTime PCR及Western blot分別檢測(cè)Trim72在mRNA和蛋白水平

10、上的干擾效果。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默Trim72后CFs細(xì)胞的增殖變化，Transwell檢測(cè)沉默Trim72后CFs細(xì)胞的遷移變化。
　　結(jié)果：采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化SD乳鼠的心臟組織，差速貼壁離心法分離心肌成纖維細(xì)胞，在含10％胎牛血清 DMEM低糖培養(yǎng)基中常規(guī)細(xì)胞條件培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)呈多樣，細(xì)胞胞體較大、平坦，形態(tài)多為紡錘形，無(wú)自發(fā)搏動(dòng)。胞質(zhì)透明，顏色淡，顯得很薄，細(xì)胞核較大呈卵圓形，居中，細(xì)胞狀態(tài)

11、良好，生長(zhǎng)迅速。在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈多角形或梭形，乳鼠心肌成纖維細(xì)胞SMA抗原表達(dá)呈陽(yáng)性，細(xì)胞純度大于97%。由此可以鑒定為心肌成纖維細(xì)胞。siRNA轉(zhuǎn)染48和72h后，Real Time PCR及 Western blot結(jié)果顯示，與空白組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 siRNA能有效沉默Trim72在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)。CCK-8和Transwell結(jié)果顯示，與空白組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組 CFs細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯下

12、降。
　　結(jié)論：沉默Trim72的表達(dá)能抑制CFs細(xì)胞的增殖和遷移能力。
　　第四部分：初步探討Trim72在心肌成纖維細(xì)胞中的分子機(jī)制研究
　　目的：初步探討Trim72在心肌成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能力中的分子機(jī)制，尋找Trim72調(diào)控的信號(hào)通路和下游靶基因。
　　方法：本部分研究運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片尋找Trim72參與的信號(hào)通路及下游靶基因；首先，我們運(yùn)用前期篩選的Trim72-siRNA轉(zhuǎn)染CFs細(xì)胞，沉默T

13、rim72的表達(dá)，Trizol提取轉(zhuǎn)染48h后的總RNA，利用大鼠基因表達(dá)譜芯片分析抑制Trim72表達(dá)后基因的表達(dá)變化。然后，運(yùn)用 EC和 TAC等軟件結(jié)合生物信息學(xué)，對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行 Gene Ontology和 Pathway信號(hào)通路分析，尋找Trim72參與的生物學(xué)過(guò)程。
　　結(jié)果：基因表達(dá)譜結(jié)果顯示，Trim72-siRNA抑制心肌成纖維細(xì)胞中Trim72的表達(dá)后，共有265個(gè)基因發(fā)生顯著性變化，其中123個(gè)基因表達(dá)

14、上調(diào)，142個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。GO生物信息學(xué)分析結(jié)果表明：上述差異表達(dá)的基因顯著富集于 Cell adhesion、Skeletal systemdevelopment、Heart development和Extracellular matrix organization等生物學(xué)過(guò)程；Pathway生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：差異表達(dá)的基因主要富集于TGF-beta signaling pathway、Cell adhesion molecu

15、les(CAMs)、Hippo signaling pathway和Calcium signaling pathway等信號(hào)通路。
　　結(jié)論：整合差異表達(dá)的結(jié)果和GO、Pathway結(jié)果，我們推測(cè)Trim72可能通過(guò) TGF-beta signaling pathway通路發(fā)揮作用， qRT-PCR和Western blot結(jié)果也得到了進(jìn)一步的驗(yàn)證。這些結(jié)果表明，Trim72可能通過(guò)上述通路和/或基因的表達(dá)變化參心肌成纖維細(xì)胞的增