密度感應(yīng)系統(tǒng)對弗氏志賀菌生長競爭能力的影響.pdf

1、志賀氏菌是細(xì)菌性痢疾的主要病原體，一般感染10-100個志賀式菌就能使人發(fā)病，全世界每年的感染人數(shù)可達(dá)到1.6億，其中發(fā)展中國家的死亡病例高達(dá)90％以上。志賀氏菌傳播的主要途徑是糞口，其可以入侵炎癥上皮細(xì)胞，導(dǎo)致膿腫和潰瘍等強烈的炎癥反應(yīng)。
　　近年來，微生物群體間的相互作用越來越引起人們的關(guān)注，細(xì)菌所表現(xiàn)出的細(xì)胞相互作用，如抗生素的產(chǎn)生、菌體自身的發(fā)育及孢子的形成等，都需要高密度細(xì)胞共同協(xié)作完成。而密度感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌間重要的交流

2、系統(tǒng)，可通過細(xì)菌密度來調(diào)控這些協(xié)作行為。
　　據(jù)研究顯示，在基因組水平上，大腸桿菌和志賀氏菌存在同源性和相似性，但兩者在表型及致病性方面表現(xiàn)出較大的差異。通過對比兩種菌的基因序列發(fā)現(xiàn)：在兩者的基因序列中，都含有密度感應(yīng)系統(tǒng)操縱子基因，但兩者存在一定差異。與大腸桿菌體內(nèi)的密度感應(yīng)系統(tǒng)相比，志賀氏菌體內(nèi)缺少了密度感應(yīng)系統(tǒng)的某些基因，如lsrK，lsrB，lsrF。
　　本研究利用傳統(tǒng)的酶切連接法構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株3

3、01/pPro-lsrBFK，利用Golden Gate克隆法構(gòu)建了完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/pET28a-lsrKG。測定了弗氏2a志賀菌301野生株，301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG的生長曲線，比較它們在生長方面的差異；將兩種不同細(xì)菌混合培養(yǎng)，通過菌落計數(shù)，分析判斷缺失基因回復(fù)后對細(xì)菌生長優(yōu)勢的影響；制備野生株301、301/pPro-lsrBFK與301/pET28a-lsrKG的蛋白樣品，進(jìn)行

4、雙向凝膠電泳，比較野生株301、301/pPro-lsrBFK與301/pET28a-lsrKG的蛋白圖譜并尋找差異蛋白點，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到差異蛋白點的信息，分析差異蛋白的可能作用。有關(guān)實驗的詳細(xì)結(jié)果，綜合如下：
　　1．利用酶切連接法和Golden Gate克隆法成功構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK和完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/pET28a-lsrKG。
　　2．利用哈氏弧菌BB170對信號分

5、子AI-2生物發(fā)光的特性，檢測弗氏2a志賀菌301可以向胞外釋放并分泌有活性的信號分子 AI-2，并使哈氏弧菌BB170產(chǎn)生熒光。
　　3．301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG與野生株301相比，在生長曲線上沒有較大差別，但301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG菌株在穩(wěn)定期達(dá)到的細(xì)菌密度更大。
　　4．對301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG，野

6、生株301，MG1655進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過菌落計數(shù)計算其生長比例，其結(jié)果表明：缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK與野生株301相比，不具有生長優(yōu)勢；而完整基因簇回復(fù)株301/pET28a-lsrKG與野生株301相比，具有較明顯的生長優(yōu)勢。
　　5．利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，對比301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG和野生株301的全菌蛋白雙向凝膠電泳圖譜，運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析差異蛋白點。結(jié)

7、果表明：缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK相對于野生株301來說，蛋白差異點不明顯；完整基因回復(fù)株301/pET28a-lsrKG相對于野生株301的蛋白圖譜分析，兩者存在多個蛋白差異點。其中比較重要的蛋白差異點有：密度感應(yīng)系統(tǒng)中信號分子的轉(zhuǎn)運蛋白LsrB蛋白；與蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶蛋白GroEL；與代謝相關(guān)的酶類，如icdA編碼的異檸檬酸脫氫酶、sdhA編碼的琥珀酸脫氫酶，以及與電子傳遞鏈相關(guān)的氧化還原酶，如fabI編碼的