密度感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)弗氏志賀菌生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力的影響.pdf

1、志賀氏菌是細(xì)菌性痢疾的主要病原體，一般感染10-100個(gè)志賀式菌就能使人發(fā)病，全世界每年的感染人數(shù)可達(dá)到1.6億，其中發(fā)展中國(guó)家的死亡病例高達(dá)90％以上。志賀氏菌傳播的主要途徑是糞口，其可以入侵炎癥上皮細(xì)胞，導(dǎo)致膿腫和潰瘍等強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。
　　近年來，微生物群體間的相互作用越來越引起人們的關(guān)注，細(xì)菌所表現(xiàn)出的細(xì)胞相互作用，如抗生素的產(chǎn)生、菌體自身的發(fā)育及孢子的形成等，都需要高密度細(xì)胞共同協(xié)作完成。而密度感應(yīng)系統(tǒng)是細(xì)菌間重要的交流

2、系統(tǒng)，可通過細(xì)菌密度來調(diào)控這些協(xié)作行為。
　　據(jù)研究顯示，在基因組水平上，大腸桿菌和志賀氏菌存在同源性和相似性，但兩者在表型及致病性方面表現(xiàn)出較大的差異。通過對(duì)比兩種菌的基因序列發(fā)現(xiàn)：在兩者的基因序列中，都含有密度感應(yīng)系統(tǒng)操縱子基因，但兩者存在一定差異。與大腸桿菌體內(nèi)的密度感應(yīng)系統(tǒng)相比，志賀氏菌體內(nèi)缺少了密度感應(yīng)系統(tǒng)的某些基因，如lsrK，lsrB，lsrF。
　　本研究利用傳統(tǒng)的酶切連接法構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株3

3、01/pPro-lsrBFK，利用Golden Gate克隆法構(gòu)建了完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/pET28a-lsrKG。測(cè)定了弗氏2a志賀菌301野生株，301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG的生長(zhǎng)曲線，比較它們?cè)谏L(zhǎng)方面的差異；將兩種不同細(xì)菌混合培養(yǎng)，通過菌落計(jì)數(shù)，分析判斷缺失基因回復(fù)后對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的影響；制備野生株301、301/pPro-lsrBFK與301/pET28a-lsrKG的蛋白樣品，進(jìn)行

4、雙向凝膠電泳，比較野生株301、301/pPro-lsrBFK與301/pET28a-lsrKG的蛋白圖譜并尋找差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到差異蛋白點(diǎn)的信息，分析差異蛋白的可能作用。有關(guān)實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)結(jié)果，綜合如下：
　　1．利用酶切連接法和Golden Gate克隆法成功構(gòu)建了密度感應(yīng)系統(tǒng)缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK和完整密度感應(yīng)系統(tǒng)回復(fù)株301/pET28a-lsrKG。
　　2．利用哈氏弧菌BB170對(duì)信號(hào)分

5、子AI-2生物發(fā)光的特性，檢測(cè)弗氏2a志賀菌301可以向胞外釋放并分泌有活性的信號(hào)分子 AI-2，并使哈氏弧菌BB170產(chǎn)生熒光。
　　3．301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG與野生株301相比，在生長(zhǎng)曲線上沒有較大差別，但301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG菌株在穩(wěn)定期達(dá)到的細(xì)菌密度更大。
　　4．對(duì)301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG，野

6、生株301，MG1655進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過菌落計(jì)數(shù)計(jì)算其生長(zhǎng)比例，其結(jié)果表明：缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK與野生株301相比，不具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；而完整基因簇回復(fù)株301/pET28a-lsrKG與野生株301相比，具有較明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。
　　5．利用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)比301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG和野生株301的全菌蛋白雙向凝膠電泳圖譜，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析差異蛋白點(diǎn)。結(jié)

7、果表明：缺失基因回復(fù)株301/pPro-lsrBFK相對(duì)于野生株301來說，蛋白差異點(diǎn)不明顯；完整基因回復(fù)株301/pET28a-lsrKG相對(duì)于野生株301的蛋白圖譜分析，兩者存在多個(gè)蛋白差異點(diǎn)。其中比較重要的蛋白差異點(diǎn)有：密度感應(yīng)系統(tǒng)中信號(hào)分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsrB蛋白；與蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶蛋白GroEL；與代謝相關(guān)的酶類，如icdA編碼的異檸檬酸脫氫酶、sdhA編碼的琥珀酸脫氫酶，以及與電子傳遞鏈相關(guān)的氧化還原酶，如fabI編碼的