鼠疫耶爾森氏菌密度感應(yīng)系統(tǒng)研究.pdf

1、目的： 鼠疫耶爾森氏菌(Yersiniapestis，以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)是一種烈性病原體，通過(guò)蚤的叮咬可以引發(fā)宿主動(dòng)物間以及人間的鼠疫爆發(fā)流行，了解鼠疫菌的致病機(jī)制才能夠有效的防治鼠疫的爆發(fā)流行。密度感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)是一種細(xì)胞密度依賴的胞間信號(hào)傳遞系統(tǒng)，通過(guò)這種機(jī)制菌群可以同步調(diào)動(dòng)大量基因的表達(dá)，體現(xiàn)出有組織的類似于多細(xì)胞生物的群體性行為。根據(jù)其他細(xì)菌QS系統(tǒng)的研究結(jié)果，該系統(tǒng)可能與鼠疫菌的致病機(jī)制相

2、關(guān)，因而對(duì)于鼠疫菌的QS系統(tǒng)進(jìn)行研究將有助于對(duì)該菌致病機(jī)制的理解。 方法： [1]QS系統(tǒng)信號(hào)分子檢測(cè)鑒定：利用QS系統(tǒng)Ⅰ型信號(hào)分子報(bào)告菌根癌農(nóng)桿菌NTL4(pZLR4)(Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4))與Ⅱ型信號(hào)分子報(bào)告菌哈氏弧菌BB170(Vibrio harveyi BB 170)對(duì)鼠疫菌是否產(chǎn)生信號(hào)分子進(jìn)行定性檢測(cè)，進(jìn)而利用HPLC-MS-MS對(duì)鼠疫菌培養(yǎng)上清中存在的Ⅰ

3、型信號(hào)分子進(jìn)行鑒定，并確定鼠疫菌Ⅰ型QS系統(tǒng)內(nèi)部存在的兩種信號(hào)分子合成酶各自對(duì)應(yīng)的合成產(chǎn)物； [2]QS系統(tǒng)效期范圍與內(nèi)調(diào)控分析：從宏觀角度，利用報(bào)告菌NTL4與BBl70，對(duì)鼠疫菌野生株及QS系統(tǒng)系列突變株Ⅰ型信號(hào)分子與Ⅱ型信號(hào)分子的生成規(guī)律進(jìn)行分析，從而明確Ⅰ型與Ⅱ型QS系統(tǒng)的效期范圍與相關(guān)性，同時(shí)預(yù)測(cè)Ⅰ型內(nèi)部?jī)商渍{(diào)控元之間的內(nèi)調(diào)控關(guān)系； [3]Ⅰ型QS系統(tǒng)與多細(xì)胞性的相關(guān)性：從表型方面，對(duì)鼠疫菌野生株與QS系統(tǒng)系列

4、突變株在LB富養(yǎng)培養(yǎng)基與TMH貧養(yǎng)培養(yǎng)基中的多細(xì)胞性(multicellularity)形成狀態(tài)與生成量進(jìn)行系統(tǒng)分析，從而對(duì)Ⅰ型系統(tǒng)內(nèi)部?jī)商渍{(diào)控元與多細(xì)胞性形成的相關(guān)性進(jìn)行分析； [4]Ⅰ型QS系統(tǒng)比較蛋白質(zhì)組分析：從微觀角度，使用雙向電泳技術(shù)，對(duì)鼠疫菌Ⅰ型QS系統(tǒng)進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組分析，揭示Ⅰ型QS系統(tǒng)與鼠疫菌在高密度條件下存活與毒力的相關(guān)性。 結(jié)果： [1]QS系統(tǒng)信號(hào)分子檢測(cè)鑒定：定性檢測(cè)的結(jié)果與基因預(yù)測(cè)一致

5、，鼠疫菌中同時(shí)存在Ⅰ型與Ⅱ型QS系統(tǒng)，經(jīng)HPLC-MS-MS鑒定，鼠疫菌所合成的Ⅰ型信號(hào)分子共有四種，即C6-HSL，C8-HSL，3-oxo-C6-HSL，3-oxo-C8-HSL，其中信號(hào)分子合成酶YpeI負(fù)責(zé)合成3-oxo-C6-HSL，信號(hào)分子合成酶YspI負(fù)責(zé)合成C6-HSL，C8-HSL，3-oxo-C6-HSL，3-oxo-C8-HSL，此外沒(méi)有其它的Ⅰ型信號(hào)分子合成酶存在； [2]QS系統(tǒng)效期范圍與內(nèi)調(diào)控分析：經(jīng)

6、報(bào)告菌的半定量分析，鼠疫菌Ⅰ型信號(hào)分子的效期范圍是從對(duì)數(shù)前期直至靜止晚期，其頂峰出現(xiàn)在進(jìn)入靜止期后約2-3h，并持續(xù)約10h才會(huì)逐漸減弱；鼠疫菌Ⅱ型信號(hào)分子的效期范圍是從對(duì)數(shù)前期至靜止期，其頂峰出現(xiàn)在對(duì)數(shù)中晚期，在靜止期到來(lái)之前徹底消失；鼠疫菌的自身生長(zhǎng)狀態(tài)實(shí)現(xiàn)了其在不同時(shí)期對(duì)于Ⅰ型QS系統(tǒng)與Ⅱ型QS系統(tǒng)的選擇；此外，經(jīng)分析預(yù)測(cè)在鼠疫菌Ⅰ型QS系統(tǒng)內(nèi)部存在自調(diào)控現(xiàn)象，即ypel/ypeR與yspl/yspR兩套調(diào)控元內(nèi)部均存在負(fù)調(diào)控回路

7、，與此同時(shí)ypel/ypeR調(diào)控元在功能上位于上游，對(duì)yspI/yspR調(diào)控元具有負(fù)調(diào)控作用； [3]Ⅰ型QS系統(tǒng)與多細(xì)胞性的相關(guān)性：經(jīng)過(guò)對(duì)鼠疫菌多細(xì)胞性的形成狀態(tài)與生成量的表型分析，發(fā)現(xiàn)QS系統(tǒng)與多細(xì)胞性的形成直接相關(guān)，ypeI/ypeR調(diào)控元的控制發(fā)揮著決定作用；[4]QS系統(tǒng)比較蛋白質(zhì)組分析：經(jīng)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，Ⅰ型OS系統(tǒng)對(duì)于鼠疫菌的自我保護(hù)、能源運(yùn)輸、能量代謝具有明顯的上調(diào)控作用，并以此增強(qiáng)鼠疫菌在靜止期高密度狀態(tài)下

8、的生存能力，可能由此間接提高了鼠疫菌的毒力，而未發(fā)現(xiàn)對(duì)鼠疫菌已知毒力因子的顯著上調(diào)作用。 結(jié)論： 對(duì)鼠疫菌OS系統(tǒng)進(jìn)行了檢測(cè)、鑒定、作用規(guī)律分析與內(nèi)調(diào)控分析；并利用表型分析對(duì)該系統(tǒng)的內(nèi)調(diào)控規(guī)律予以補(bǔ)充；在此基礎(chǔ)上，最終利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)Ⅰ型QS系統(tǒng)的調(diào)控功能進(jìn)行了分析；結(jié)果顯示，Ⅰ型QS系統(tǒng)對(duì)于鼠疫菌的自我保護(hù)、能源運(yùn)輸、能量代謝具有明顯的上調(diào)控作用，并以此增強(qiáng)鼠疫菌在高密度狀態(tài)下的生存能力，可能間接提高鼠疫菌的毒力，