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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:本課題是國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目―當(dāng)歸四逆湯解痙通脈機(jī)制研究的一部分。當(dāng)歸是當(dāng)歸四逆湯的主藥,阿魏酸是當(dāng)歸的主要活性成分。本課題通過(guò)建立不同溫度HUVECs急性冷刺激模型,觀察阿魏酸是否通過(guò)TRPM8/HIF-1α/ET-1信號(hào)通路介導(dǎo)ET-1合成和分泌,調(diào)控ET-NO平衡,參與內(nèi)皮依賴性血管收縮舒張功能調(diào)節(jié)。
方法:HUVECs培養(yǎng)至95%融合后,分別用18℃、4℃刺激5小時(shí),空白對(duì)照組培養(yǎng)溫度保持37℃,阿魏酸干預(yù)使用5
2、0μM、100μM、200μM三個(gè)劑量組,并分別設(shè)置TRPM8拮抗劑AMTB組(20μM)及TRPM8激動(dòng)劑WS-12(20μM)。采用MTT法檢測(cè)HUVECs細(xì)胞活性,收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞,生化檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量和LDH活性。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中ET-1含量,Q-PCR法檢測(cè)HUVECs TRPM8、iNOS、eNOS、ET-1 mRNA表達(dá),Western Blot法檢測(cè)HUVECs TRPM8、HIF-1α、iNOS
3、、eNOS、ET-1蛋白表達(dá)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以x?s表示,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,組間比較采用 SNK法或Tamhane`s T2法。
結(jié)果:與空白對(duì)照組相比,18℃模型組HUVECs形態(tài)無(wú)明顯改變,4℃模型組細(xì)胞皺縮,邊緣不規(guī)則,細(xì)胞間距增大;18℃模型組培養(yǎng)基中 LDH活性和 ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05),培養(yǎng)基中NO含量、eNOS表達(dá)水平顯著降低(
4、P<0.05);4℃模型組培養(yǎng)基中 NO含量、LDH活性和HUVECs細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05),培養(yǎng)基中ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1、eNOS和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與18℃模型組相比,中、高劑量阿魏酸組培養(yǎng)基中LDH活性和ET-1含量、TRPM8、iNOS、ET-1和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),拮抗劑組培養(yǎng)基中ET-1含量和激動(dòng)劑組培養(yǎng)基中LDH活性和iNOS表達(dá)水平顯
5、著降低(P<0.05),培養(yǎng)基中NO含量、eNOS表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05),激動(dòng)劑組培養(yǎng)基中 ET-1含量、ET-1和 HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05)。和18℃激動(dòng)劑組相比,激動(dòng)劑+阿魏酸組培養(yǎng)基中ET-1含量、ET-1、iNOS和HIF-1α表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與4℃模型組相比,中、高劑量阿魏酸組細(xì)胞活力、TRPM8、eNOS和 HIF-1α表達(dá)水平顯著增強(qiáng)(P<0.05),拮抗劑組培養(yǎng)基中 LDH
6、活性和激動(dòng)劑組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)(P<0.05),拮抗劑組細(xì)胞活力和激動(dòng)劑培養(yǎng)基中 LDH活性顯著降低(P<0.05)。
結(jié)論:1、不同溫度低溫暴露對(duì)TRPM8表達(dá)呈相反影響,18℃上調(diào)TRPM8表達(dá),4℃下調(diào)TRPM8表達(dá);2、18℃冷暴露可能通過(guò)TRPM8/HIF-1α/ET-1介導(dǎo)內(nèi)皮功能調(diào)節(jié);3、TRPM8可能通過(guò)降低iNOS表達(dá)、提高線粒體能量代謝、保護(hù)胞膜完整性在冷暴露中起保護(hù)作用;4、阿魏酸對(duì) TRPM8表達(dá)呈雙向
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