自噬相關基因遺傳變異與非小細胞肺癌預后的關聯(lián)及功能研究.pdf

1、背景:世界范圍內，肺癌是最為常見的一種惡性腫瘤，據估計，僅2012年，全球共有180萬例肺癌新發(fā)病例，占所有腫瘤的13％，我國肺癌發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，且一直高于世界平均水平。因此，肺癌嚴重威脅我國居民生命健康，是亟待解決的公共衛(wèi)生問題。非小細胞肺癌(Non-small cell lungcancer，NSCLC)在所有肺癌病例中的比例超過85％。早期NSCLC的主要治療手段是手術治療，但由于其復發(fā)和轉移率高，NSCLC患者的5年生

2、存率仍低于20％。目前已知的肺癌預后影響因素包括臨床分期、組織學類型、吸煙情況等，但即使臨床分期或其他宏觀因素相同的患者其預后也存在較大差異。因此，發(fā)現和應用特定生物標志物，評估這些分子事件或者中間標志物在肺癌患者預后中的作用，結合傳統(tǒng)的臨床分期，將有助于更好的指導臨床治療和隨訪監(jiān)測。
　　自噬(autophagy)是非原核生物中一種進化高度保守的自我消耗過程。其本質上是細胞內的一種應激反應機制，使細胞內的蛋白質和損傷細胞器在溶酶

3、體的作用下重新被細胞捕獲利用。自噬是自噬體結構演變的動態(tài)過程，主要包括自噬體的形成、自噬體的延長、成熟、自噬體與溶酶體融合并酶解物質這4個部分，整個過程是由一系列自噬相關基因（autophagy-related genes，ATGs）調控的。自噬體的形成依賴兩條經典的泛素化-蛋白系統(tǒng):ATG12與微管相關蛋白1輕鏈3(the microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)系統(tǒng)。目前已發(fā)

4、現了34種自噬相關基因，主要包括ATG3，ATG5，ATG7，ATG10，ATG12等。眾多研究證實自噬相關基因(ATGs)在腫瘤的發(fā)病機理、臨床治療以及預后方面發(fā)揮著重要的生物學作用。然而，目前尚未有研究闡明上述自噬相關基因與非小細胞肺癌預后的關聯(lián)及調控機制。
　　單核苷酸多態(tài)性(SNP)可通過直接或間接調控基因的表達水平，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。其中，表達數量性狀定位分析(Expression Quantitative Tra

5、itLoci，eQTL)是一種采用DNA微陣列技術分析群體中個體的基因表達譜，將基因表達水平作為數量性狀采用QTL分析定位控制該基因的表達QTL的一種分析方法，主要用于闡述潛在功能性遺傳變異位點對基因表達水平影響。特定位點的DNA甲基化水平的遺傳變異，也被稱之為甲基化表達數量性狀基因座（methylation quantitative trait loci，meQTL）。meQTL分析方法與eQTL分析類似，是將基因表達水平作為數量性狀

6、，探討DNA甲基化水平與基因表達之間關系的分析方法。因此，eQTL和meQTL分析方法綜合考慮SNP、DNA甲基化水平和基因表達的相關性，在遺傳學和表觀遺傳學方面建立了良好的功能學聯(lián)系，可闡述疾病相關遺傳變異的作用方式。
　　目的:探討自噬通路相關基因遺傳變異與中國人群非小細胞肺癌預后的關聯(lián)及功能。
　　方法:本研究選擇了自2003年6月以來在江蘇省人民醫(yī)院和江蘇省腫瘤醫(yī)院收集的1341例非小細胞肺癌病例，所有病例均經病理組

7、織學和細胞學明確診斷。所有的病例自收集之日起，按預先設計好的隨訪周期和方式（電話隨訪患者本人或其家屬）進行定期隨訪，主要的隨訪內容包括患者后續(xù)治療情況、轉移與復發(fā)、死亡信息等。生存時間定義為確診日期至死亡日期或者最近一次隨訪日期（2013年8月）。截至2013年8月，共有1001例病例成功完成隨訪，隨訪成功率為74.6％，中位生存期(median survival time，MST)為26個月。
　　候選基因包括參與自噬體形成的A

8、TG3，ATG5，ATG7，ATG10，ATG12這5個重要的自噬相關基因(ATGs)。運用HapMap SNP數據庫(phaseⅡ+Ⅲ Feb09，on NCBI B36 assembly，dbSNP b126)以及HaploView4.2軟件進行選點，并運用SNPinfo網站(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)進行功能學預測。最終，共有14個SNPs納入本研究。采用Illumina Infinium(@)

9、Human Exome BeadChip芯片進行基因分型。
　　生物信息學及統(tǒng)計分析方法主要包括運用GTEx肺組織和TCGA數據庫中肺腺癌樣本信息，運用eQTL和meQTL分析方法進行位點與mRNA表達水平、甲基化位點之間的關聯(lián)分析，用Spearman等級相關分析基因型、甲基化以及基因表達之間的關系。生存曲線采用Kaplan-Meier方法繪制、運用Log-rank檢驗生存時間之間的差異，單因素和多因素Cox回歸計算風險比例，t檢

10、驗進行細胞增殖和遷移數據分析。
　　功能學實驗包括采用RTCA和CCK8細胞增殖實驗檢測肺癌細胞的增殖情況、RTCA和Transwell小室實驗檢測肺癌細胞的遷移情況、Real-Time PCR檢測基因的表達情況。
　　結果:ATG10 rs1864183的不同基因型攜帶者的生存時間存在差異（相加模型和顯性模型下Log-rank P＜0.05）。多因素Cox回歸模型表明，在調整了年齡、性別、吸煙情況、手術治療、臨床分期、放療

11、、化療以及組織學類型后，ATG10 rs10514231、rs1864182及rs1864183與非小細胞肺癌患者的死亡風險存在顯著關聯(lián)。eQTL分析結果顯示，ATG10上3個候選SNPs的突變型等位基因(rs10514231 G，rs1864182 C和rs1864183 G)與ATG10的mRNA表達水平升高顯著相關（P值分別為8×10-12，7×10-11和0.02）。Cox回歸模型表明，在校正了年齡、性別和臨床分期之后，ATG1

12、0 mRNA表達升高顯著增加非小細胞肺癌患者的死亡風險（校正HR=2.10，95％CI=1.33-3.29，P=0.001）。meQTL分析結果顯示，在校正了年齡、性別和臨床分期之后，ATG10上CpG位點cg17942617的高甲基化會增加肺癌患者死亡風險(校正HR=1.77，95％CI=1.06-2.97，P=0.029)。同時，ATG10 rs10514231和rs1864182突變型等位基因對應的CpG位點cg17942617的

13、甲基化水平更高（P值分別為0.006和0.017）。線性回歸模型結果表明，隨著cg17942617甲基化水平的增加，ATG10 mRNA表達水平也顯著增加，非小細胞肺癌患者的生存時間顯著縮短(rho=0.129，P=0.008)。細胞學實驗證實，過表達ATG10可導致肺癌細胞A549和H1299增殖和遷移能力增強;siRNA下調ATG10表達可導致肺癌細胞A549和H1299增殖和遷移能力減弱。
　　結論:本課題首次探討了自噬相關