自噬相關(guān)基因遺傳變異與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)及功能研究.pdf

1、背景:世界范圍內(nèi)，肺癌是最為常見的一種惡性腫瘤，據(jù)估計(jì)，僅2012年，全球共有180萬例肺癌新發(fā)病例，占所有腫瘤的13％，我國肺癌發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，且一直高于世界平均水平。因此，肺癌嚴(yán)重威脅我國居民生命健康，是亟待解決的公共衛(wèi)生問題。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lungcancer，NSCLC)在所有肺癌病例中的比例超過85％。早期NSCLC的主要治療手段是手術(shù)治療，但由于其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，NSCLC患者的5年生

2、存率仍低于20％。目前已知的肺癌預(yù)后影響因素包括臨床分期、組織學(xué)類型、吸煙情況等，但即使臨床分期或其他宏觀因素相同的患者其預(yù)后也存在較大差異。因此，發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用特定生物標(biāo)志物，評(píng)估這些分子事件或者中間標(biāo)志物在肺癌患者預(yù)后中的作用，結(jié)合傳統(tǒng)的臨床分期，將有助于更好的指導(dǎo)臨床治療和隨訪監(jiān)測。
　　自噬(autophagy)是非原核生物中一種進(jìn)化高度保守的自我消耗過程。其本質(zhì)上是細(xì)胞內(nèi)的一種應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和損傷細(xì)胞器在溶酶

3、體的作用下重新被細(xì)胞捕獲利用。自噬是自噬體結(jié)構(gòu)演變的動(dòng)態(tài)過程，主要包括自噬體的形成、自噬體的延長、成熟、自噬體與溶酶體融合并酶解物質(zhì)這4個(gè)部分，整個(gè)過程是由一系列自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATGs）調(diào)控的。自噬體的形成依賴兩條經(jīng)典的泛素化-蛋白系統(tǒng):ATG12與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(the microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)系統(tǒng)。目前已發(fā)

4、現(xiàn)了34種自噬相關(guān)基因，主要包括ATG3，ATG5，ATG7，ATG10，ATG12等。眾多研究證實(shí)自噬相關(guān)基因(ATGs)在腫瘤的發(fā)病機(jī)理、臨床治療以及預(yù)后方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。然而，目前尚未有研究闡明上述自噬相關(guān)基因與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)及調(diào)控機(jī)制。
　　單核苷酸多態(tài)性(SNP)可通過直接或間接調(diào)控基因的表達(dá)水平，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。其中，表達(dá)數(shù)量性狀定位分析(Expression Quantitative Tra

5、itLoci，eQTL)是一種采用DNA微陣列技術(shù)分析群體中個(gè)體的基因表達(dá)譜，將基因表達(dá)水平作為數(shù)量性狀采用QTL分析定位控制該基因的表達(dá)QTL的一種分析方法，主要用于闡述潛在功能性遺傳變異位點(diǎn)對基因表達(dá)水平影響。特定位點(diǎn)的DNA甲基化水平的遺傳變異，也被稱之為甲基化表達(dá)數(shù)量性狀基因座（methylation quantitative trait loci，meQTL）。meQTL分析方法與eQTL分析類似，是將基因表達(dá)水平作為數(shù)量性狀

6、，探討DNA甲基化水平與基因表達(dá)之間關(guān)系的分析方法。因此，eQTL和meQTL分析方法綜合考慮SNP、DNA甲基化水平和基因表達(dá)的相關(guān)性，在遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)方面建立了良好的功能學(xué)聯(lián)系，可闡述疾病相關(guān)遺傳變異的作用方式。
　　目的:探討自噬通路相關(guān)基因遺傳變異與中國人群非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)聯(lián)及功能。
　　方法:本研究選擇了自2003年6月以來在江蘇省人民醫(yī)院和江蘇省腫瘤醫(yī)院收集的1341例非小細(xì)胞肺癌病例，所有病例均經(jīng)病理組

7、織學(xué)和細(xì)胞學(xué)明確診斷。所有的病例自收集之日起，按預(yù)先設(shè)計(jì)好的隨訪周期和方式（電話隨訪患者本人或其家屬）進(jìn)行定期隨訪，主要的隨訪內(nèi)容包括患者后續(xù)治療情況、轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)、死亡信息等。生存時(shí)間定義為確診日期至死亡日期或者最近一次隨訪日期（2013年8月）。截至2013年8月，共有1001例病例成功完成隨訪，隨訪成功率為74.6％，中位生存期(median survival time，MST)為26個(gè)月。
　　候選基因包括參與自噬體形成的A

8、TG3，ATG5，ATG7，ATG10，ATG12這5個(gè)重要的自噬相關(guān)基因(ATGs)。運(yùn)用HapMap SNP數(shù)據(jù)庫(phaseⅡ+Ⅲ Feb09，on NCBI B36 assembly，dbSNP b126)以及HaploView4.2軟件進(jìn)行選點(diǎn)，并運(yùn)用SNPinfo網(wǎng)站(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)進(jìn)行功能學(xué)預(yù)測。最終，共有14個(gè)SNPs納入本研究。采用Illumina Infinium(@)

9、Human Exome BeadChip芯片進(jìn)行基因分型。
　　生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)分析方法主要包括運(yùn)用GTEx肺組織和TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌樣本信息，運(yùn)用eQTL和meQTL分析方法進(jìn)行位點(diǎn)與mRNA表達(dá)水平、甲基化位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)分析，用Spearman等級(jí)相關(guān)分析基因型、甲基化以及基因表達(dá)之間的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier方法繪制、運(yùn)用Log-rank檢驗(yàn)生存時(shí)間之間的差異，單因素和多因素Cox回歸計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比例，t檢

10、驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞增殖和遷移數(shù)據(jù)分析。
　　功能學(xué)實(shí)驗(yàn)包括采用RTCA和CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測肺癌細(xì)胞的增殖情況、RTCA和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測肺癌細(xì)胞的遷移情況、Real-Time PCR檢測基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:ATG10 rs1864183的不同基因型攜帶者的生存時(shí)間存在差異（相加模型和顯性模型下Log-rank P＜0.05）。多因素Cox回歸模型表明，在調(diào)整了年齡、性別、吸煙情況、手術(shù)治療、臨床分期、放療

11、、化療以及組織學(xué)類型后，ATG10 rs10514231、rs1864182及rs1864183與非小細(xì)胞肺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)。eQTL分析結(jié)果顯示，ATG10上3個(gè)候選SNPs的突變型等位基因(rs10514231 G，rs1864182 C和rs1864183 G)與ATG10的mRNA表達(dá)水平升高顯著相關(guān)（P值分別為8×10-12，7×10-11和0.02）。Cox回歸模型表明，在校正了年齡、性別和臨床分期之后，ATG1

12、0 mRNA表達(dá)升高顯著增加非小細(xì)胞肺癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)（校正HR=2.10，95％CI=1.33-3.29，P=0.001）。meQTL分析結(jié)果顯示，在校正了年齡、性別和臨床分期之后，ATG10上CpG位點(diǎn)cg17942617的高甲基化會(huì)增加肺癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)(校正HR=1.77，95％CI=1.06-2.97，P=0.029)。同時(shí)，ATG10 rs10514231和rs1864182突變型等位基因?qū)?yīng)的CpG位點(diǎn)cg17942617的

13、甲基化水平更高（P值分別為0.006和0.017）。線性回歸模型結(jié)果表明，隨著cg17942617甲基化水平的增加，ATG10 mRNA表達(dá)水平也顯著增加，非小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間顯著縮短(rho=0.129，P=0.008)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)ATG10可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞A549和H1299增殖和遷移能力增強(qiáng);siRNA下調(diào)ATG10表達(dá)可導(dǎo)致肺癌細(xì)胞A549和H1299增殖和遷移能力減弱。
　　結(jié)論:本課題首次探討了自噬相關(guān)