重組人胰島素在大腸桿菌中的表達及分離純化.pdf

1、胰島素用于臨床已有80多年的歷史，由于它是治療糖尿病的特效藥物和糖尿病患者在人口中的比例相當高，所以對胰島素的需求量一直很大，這就促使人們不斷尋求和探索更加有效的表達系統(tǒng)和表達策略。 本實驗室利用基因工程的方法將改造后的人胰島素原基因加載到質粒pET<,28>(+)a上，然后將其轉化入大腸桿菌Rosetta<,tm>(DE3)，經過菌種選育，獲得了重組人胰島素的高水平表達，并通過對實驗室搖瓶培養(yǎng)條件的研究，得到了優(yōu)化后的發(fā)酵條

2、件：基因工程大腸桿菌生長2h菌體密度就能達到OD<,600>值0.8，在此時加入誘導劑效果最好，誘導劑IPTG濃度為0.5 mmol/L；誘導4h；誘導溫度為37℃；Kana濃度對菌體蛋白的表達影響不大，加入30mg/L用以抑制雜菌的生長。 重組人胰島素原在大腸桿菌中表達時易形成不溶性、無活性的包涵體，因此，必須經過體外變性、復性的過程。為了減少包涵體中的雜質對復性產生的影響，需要在復性前對菌體及包涵體進行洗滌，實驗對含有不同

3、尿素濃度的洗滌液進行試驗比較，最后選定用含2 mol/L尿素的包涵體洗滌緩沖液對包涵體進行洗滌3次。通過對變性液中DTT濃度、復性液中氧化還原對條件、pH值、小分子添加劑以及復性方式等多種因素進行的研究，得出了包涵體目的蛋白變性液的優(yōu)化復性條件：DTT濃度為60mmol/L，GSSG濃度為0.2mmol/L，GSSG：GSH為1：10，pH值為9.5，添加甘氨酸濃度為60 mmol/L，優(yōu)化后的重組人胰島素的復性率提高到65％。

4、 本實驗還研究了目的蛋白分離純化方法和酶切條件，尋找到合適的分離手段和酶切條件：復性液過DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析柱，pH值6.5，流速0.8ml/min，0.05mol/L可以將雜蛋白洗脫下來，0.1mol/L時洗脫目的蛋白，能夠得到較純的重組人胰島素原。純化后的重組人胰島素原經TPCK—胰蛋白酶和羧肽酶B的協(xié)同酶切、Sephadex G-25柱純化后，得到了重組人胰島素。SDS-PAGE電泳分