重組人FL在大腸桿菌中的高效表達(dá)和生物學(xué)活性的鑒定.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)FL基因進(jìn)行改造后的合成基因，在大腸桿菌體系中高效地表達(dá)了FL功能片段，通過(guò)對(duì)包涵體變性和復(fù)性，應(yīng)用HiTrapTM柱一步純化獲得了較高純度的rhFL134重組蛋白。并用經(jīng)典的集落形成實(shí)驗(yàn)和CD34+細(xì)胞的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)證實(shí)了rhFL134重組蛋白具有顯著的生物學(xué)活性。本實(shí)驗(yàn)為具有生物學(xué)活性的rhFL的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有效的方案，為FL的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。一、fl134表達(dá)載體的構(gòu)建　　以本實(shí)驗(yàn)室的合成FL胞外段基

2、因和天然的fl基因?yàn)槟０?，?yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增出對(duì)FL蛋白生物學(xué)活性至關(guān)重要的前134個(gè)氨基酸的基因序列(fl134)，克隆入pET30a表達(dá)載體，并且在FL的N端引入了一個(gè)Met和C端加了Leu和Glu各一個(gè)pET30a表達(dá)載體，并且在FL的N端引入了一個(gè)Met和C端加了Leu和Glu各一個(gè)及6個(gè)His，進(jìn)而轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21中。　 二、FL134重組蛋白的表達(dá)純化只有FL合成基因能在大腸桿菌體系中表達(dá)，而天然基因在此體系中得不到

3、表達(dá)。 三、rhFL134重組蛋白的生物學(xué)鑒定1、重組rhFL134蛋白對(duì)小鼠骨髓混合集落形成的促進(jìn)作用聯(lián)合mGM-CSF(20μg/L)和mIL-3(1ml/LWEHI培養(yǎng)上清)，在重組蛋白rhFL134對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的混合集落(CFU-mix)形成實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)重組蛋白rhFL134與陰性對(duì)照相比有顯著的促集落形成的作用，與商品化的rhFL的作用相似，其效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈劑量相關(guān)性。2、重組人rhFL134蛋白對(duì)人臍帶血中CD