抗腫瘤新藥—豹蛙酶在大腸桿菌中的克隆表達及分離純化.pdf

1、豹蛙酶(Onconase)是一種能夠有效地抑制人白血病細胞和人腺癌細胞生長的核糖核酸酶，尤其對惡性間皮瘤療效顯著，目前已進入Ⅲ期臨床研究階段。本實驗采用基因工程方法使豹蛙酶在大腸桿菌中得到高效表達，并研究其分離純化工藝，得到生物活性較好的重組豹蛙酶蛋白。
　　 設計重組豹蛙酶的結構，在天然豹蛙酶序列前端添加腸激酶酶切位點，根據其氨基酸序列，采用大腸桿菌偏愛密碼子設計合成8段引物，采用重疊延伸PCR法合成出目的基因，約350bp。

2、將得到的片斷克隆于載體pGEM-T中并測序，再連接至表達載體pET-22b(+)中，重組質粒轉入大腸桿菌Rosettatm(DE3)中。轉化的重組大腸桿菌以IPTG誘導外源基因表達，采用Tricine-SDS-PAGE系統(tǒng)，分析目標蛋白主要以包涵體形式存在。溫度為37℃時，pH為7.0，以物質的量濃度為0.5mmol/L的IPTG誘導4h，目的基因在大腸桿菌中的表達最佳，其質量分數可達48.8％。利用液相電噴霧串聯(lián)質譜方式(LC-ESI

3、-MS/MS)鑒定蛋白，通過LCQ DECA XP Plus系統(tǒng)進行蛋白序列的分析，其覆蓋率達到35％，確定了其蛋白質一級結構的正確性。
　　 通過對重組豹蛙酶的表達模式的研究，進一步確定其分離純化工藝。包涵體經洗滌、變性、復性，使用腸激酶將融合蛋白部分切除，再采用SPFF強陽離子交換層析純化，硫酸銨沉淀濃縮后，再通過Sephadex G-25分子篩收集活性組分，得到了純度97.5％的豹蛙酶蛋白，發(fā)酵總產量達255mg/L，并具