miR-214對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：隨著現(xiàn)代生活方式的改變、生活節(jié)奏的加快和人口老齡化的日益嚴(yán)重，心臟疾病發(fā)病率的升高和發(fā)病的普遍性、年輕化將日益突出。心肌細(xì)胞凋亡并不是某一個(gè)獨(dú)立的心臟疾病，而是作為一個(gè)病理過(guò)程參與了多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展，缺血性心肌病、心律失常、先天性心臟病、心臟過(guò)負(fù)荷、心肌的病毒感染、心肌重塑及心力衰竭等疾病均與其有著密切的關(guān)系。然而，目前對(duì)心肌細(xì)胞凋亡尚缺乏足夠深入的理解，引起凋亡的多種因素、各因素間的相互作用以及下游信號(hào)通路的傳遞均有待進(jìn)

2、一步深入研究。miRNA是非編碼RNA的一類，是由內(nèi)源基因編碼的單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為18-24個(gè)核苷酸。目前的研究已經(jīng)表明這類小分子物質(zhì)在基因調(diào)控中起著廣泛的作用。對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡而言，闡明miRNA是如何通過(guò)某些途徑調(diào)控這一復(fù)雜過(guò)程是非常必要的，值得進(jìn)一步探索。本研究希望能研究某個(gè)miRNA在心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控中扮演的作用。
　　目的：采用real time PCR的方法驗(yàn)證miR-214在心肌細(xì)胞接受氧化應(yīng)激后的表達(dá)情況。

3、根據(jù)流式細(xì)胞技術(shù)及western Blot等實(shí)驗(yàn)方法表明miR-214在心肌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。并且通過(guò)生物信息學(xué)的方法，對(duì)miR-214的下游靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠模型，進(jìn)一步研究miR-214調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　方法：⑴分別以不同濃度和不同作用時(shí)間的過(guò)氧化氫刺激大鼠原代心肌細(xì)胞，模擬體內(nèi)心肌細(xì)胞接受氧自由基氧化應(yīng)激的過(guò)程，采用real time PCR檢測(cè)miR-214的表達(dá)變化情況

4、;⑵在心肌細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-214后再予適當(dāng)濃度過(guò)氧化氫處理，與對(duì)照組相比，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和western blot的方法分別檢測(cè)凋亡細(xì)胞數(shù)的比例以及相關(guān)蛋白表達(dá)情況;⑶使用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-214進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，然后利用real time PCR、western Blot等方法驗(yàn)證靶基因mRNA以及蛋白表達(dá)量是否在miR-214過(guò)表達(dá)后發(fā)生相應(yīng)變化，并利用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)對(duì)miR-214的靶序列進(jìn)行驗(yàn)證;⑷結(jié)合miR-214轉(zhuǎn)

5、基因小鼠模型，利用real time PCR、western blot及免疫組化等方法再次從動(dòng)物水平驗(yàn)證miR-214下游靶基因并分析其調(diào)控凋亡過(guò)程的具體分子機(jī)制。
　　結(jié)果：①不同濃度的過(guò)氧化氫同時(shí)作用心肌細(xì)胞6小時(shí)，隨著濃度的提高，miR-214的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)氧化氫應(yīng)激時(shí)miR-214表達(dá)量明顯低于正常心肌細(xì)胞。100uM終濃度的過(guò)氧化氫分別作用心肌細(xì)胞予不同的時(shí)間，選取0h、1h、2h、

6、4h、8h及12h為檢測(cè)點(diǎn)，隨著氧化應(yīng)激作用時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-214的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)。②體外轉(zhuǎn)染miR-214 mimic至心肌細(xì)胞使miR-214過(guò)表達(dá)，然后再分別予0uM(NC)和100uM濃度的過(guò)氧化氫處理誘導(dǎo)其凋亡。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和westernblot實(shí)驗(yàn)表明，miR-214過(guò)表后的心肌細(xì)胞具有較低的細(xì)胞凋亡率，凋亡相關(guān)蛋白active-caspase3及cleaved PARP的表達(dá)也較對(duì)照組低。③應(yīng)用在線靶基因

7、預(yù)測(cè)軟件，預(yù)測(cè)在大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi)，bim、bak1、bax、bnip3和casp7都有可能是miR-214的靶基因，進(jìn)一步通過(guò)real time PCR和westernBlot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-214后mRNA水平和蛋白水平均有下調(diào)的有bim、bax及casp7。接下來(lái)的熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)分析進(jìn)一步表明它們有可能是miR-214的直接作用靶點(diǎn)，其3'-UTR中都存在與miR-214結(jié)合的作用位點(diǎn)。④通過(guò)構(gòu)建miR-214轉(zhuǎn)基因小鼠