miR-214對(duì)Ubc9的表達(dá)調(diào)控及其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、SUMO(small ubiquitin-like modifier，泛素類似分子家族成員)。Sumoylation是蛋白質(zhì)修飾的一種，與泛素化修飾過(guò)程類似，通過(guò)級(jí)聯(lián)的酶促反應(yīng)，將SUMO分子共價(jià)交聯(lián)到目的蛋白的賴氨酸殘基上，即完成SUMO化修飾。蛋白質(zhì)的SUMO化修飾涉及眾多的細(xì)胞生理和病理過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生。
　　 Ubc9(ubiquitin-like protein SUMO conjugating enzyme9)是

2、SUMO化修飾中唯一的E2結(jié)合酶，其結(jié)構(gòu)和功能的異常直接影響細(xì)胞蛋白SUMO化水平。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在卵巢癌等腫瘤中存在Ubc9表達(dá)升高的現(xiàn)象，提示Ubc9的高表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
　　 本部分研究中，我們首先選了9例神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本組織（包括Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)各3例）、4株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(T98G、A172、U87MG和U251)和2例正常腦組織，用Western blot的方法檢測(cè)了Ubc9在其中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在神

3、經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Ubc9的表達(dá)高于正常腦組織，且其表達(dá)和病理分級(jí)相關(guān)，病理分級(jí)越高，Ubc9表達(dá)越高;細(xì)胞系中除U87MG外Ubc9的表達(dá)均表現(xiàn)為不同程度的升高。Real-timePCR結(jié)果表明四株神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Ubc9的mRNA表達(dá)量與蛋白表達(dá)量并不匹配，提示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在Ubc9表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，miRNA可能參與了Ubc9的表達(dá)調(diào)控。
　　 MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要通過(guò)以不完全

4、互補(bǔ)的形式結(jié)合到目的基因的3'非編碼區(qū)(3'UTR)，來(lái)抑制靶基因的表達(dá)，是一種重要的蛋白表達(dá)調(diào)控方式，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起到十分重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs在膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常。
　　 我們結(jié)合生物信息學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)尋找可能作用于Ubc9的miRNA:首先利用TargetScan等對(duì)Ubc9的3'端非編碼區(qū)可能結(jié)合的miRNA進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并用Real-time PCR檢測(cè)了部分miRNAs在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞

5、系中的表達(dá)。依據(jù)Ubc9蛋白表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤中有升高的趨勢(shì)，故選擇在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低的miRNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-214和miR-203在神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理組織中低表達(dá)。后續(xù)的蛋白水平分析和熒光素酶活性分析結(jié)果進(jìn)一步確定miRNA-214是Ubc9表達(dá)的調(diào)控因子。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-214對(duì)Ubc9的表達(dá)調(diào)控，將miR-214的成熟序列轉(zhuǎn)染T98G細(xì)胞和A172細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到T98G和A172細(xì)胞增殖減緩，隨后用

6、TUNEL顯色檢測(cè)了細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)miR-214過(guò)表達(dá)后細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例與對(duì)照組相比明顯升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Western blot結(jié)果表明在兩種細(xì)胞系中miR-214的過(guò)表達(dá)下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)源性Ubc9的表達(dá)。
　　 將針對(duì)Ubc9的siRNA序列分別轉(zhuǎn)染T98G和A172細(xì)胞，采用相同的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞的變化，結(jié)果表明:在兩種細(xì)胞系中，Ubc9的敲低會(huì)引起細(xì)胞增殖減緩，而TUNEL顯色實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)Ubc9敲低后細(xì)胞發(fā)生凋

7、亡的比例明顯升高，說(shuō)明Ubc9的表達(dá)變化影響了細(xì)胞凋亡相關(guān)的通路。siRNA引起的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)與miR-214過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的類似，進(jìn)一步說(shuō)明miR-214影響到神經(jīng)膠質(zhì)瘤中Ubc9的表達(dá)。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染針對(duì)Ubc9的siRNA序列或miR-214成熟序列引起的Ubc9表達(dá)水平降低均伴隨著細(xì)胞SUMO化程度的減弱，表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中miR-214通過(guò)對(duì)Ubc9的表達(dá)調(diào)控影響了細(xì)胞的SUMO化狀態(tài)。
　　 從上述實(shí)驗(yàn)