miR-22對(duì)心肌細(xì)胞自噬和凋亡的調(diào)控研究.pdf

1、目的:
　　缺血性心臟病，尤其是急性心肌梗死已成為世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死發(fā)生時(shí)缺血區(qū)域既發(fā)生心肌細(xì)胞自噬也發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡。
　　miRNA是一種小分子非編碼RNA，主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。本課題中我們發(fā)現(xiàn)EBSS饑餓處理后心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的自噬和凋亡，此外miR-22的表達(dá)也明顯下調(diào)，說(shuō)明miR-22可能參與調(diào)控EBSS饑餓引起的心肌細(xì)胞自噬和凋亡。
　　方法:
　?。ㄒ?/p>

2、）乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)
　　新生2天的SD大鼠表面消毒后取出心臟，D-hanks洗滌心臟，去除心房結(jié)構(gòu)，將心室剪成1 mm3的組織塊，然后用1％的Ⅰ型膠原酶5ml4℃冰消化過(guò)夜(18h)，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱消化5-10分鐘并吹打組織塊直至消化完全，加入完全DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心后D-hanks液重懸洗滌并再次離心，沉淀用培養(yǎng)基重懸后采用差速貼壁分離出心肌細(xì)胞。以0.1 mM BrdU的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞，以EBSS

3、培養(yǎng)構(gòu)建心肌細(xì)胞饑餓模型。
　?。ǘ?shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)
　　大鼠心肌細(xì)胞總RNA由Trizol方法抽提，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR按照SYBR GreenⅠ法進(jìn)行，U6作為內(nèi)參。
　?。ㄈ┫俨《緲?gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　miR-22過(guò)表達(dá)腺病毒的構(gòu)建按AdEasy腺病毒包裝系統(tǒng)具體方法實(shí)施，腺病毒滴度按細(xì)胞病變(CPE)法測(cè)定。miR-22 inhibitor經(jīng)Lipofectamine200

4、0包裝后轉(zhuǎn)入心肌細(xì)胞。Control inhibitor轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用qRT-PCR檢測(cè)miR-22過(guò)表達(dá)腺病毒和miR-22 inhibitor轉(zhuǎn)染效率。
　?。ㄋ模┑鞍酌庖哂≯E檢測(cè)(Western blot)
　　采用Western blot分析心肌細(xì)胞中蛋白LC3、P62、P38α和GAPDH的表達(dá)水平。心肌細(xì)胞經(jīng)含有PMSF的RIPA裂解液裂解后提取蛋白。測(cè)定蛋白濃度后配平上樣，常規(guī)SDS-PAGE

5、電泳，1h濕轉(zhuǎn)。然后用5％脫脂牛奶封閉，孵育一抗4℃過(guò)夜，室溫孵育二抗1h。Odyssey紅外激光掃描條帶，并用軟件分析蛋白條帶。
　?。ㄎ澹┘?xì)胞免疫熒光和免疫組化染色
　　細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)接受不同處理后，用4％多聚甲醛室溫固定10min，用0.1％TritonⅩ-100室溫透膜10min，然后用5％山羊血清室溫封閉30min，加anti-LC3抗體室溫下孵育1h，PBST清洗3次，加入抗兔IgG二抗室溫避光孵育30min。0

6、.1％ DAPI染核，封片，然后激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
　　心臟免疫組化染色，心肌組織經(jīng)4％多聚甲醛固定24h后石蠟包埋并切片。石蠟切片脫蠟并逐漸水合，然后用5％的山羊血清封閉10min，4℃孵育anti-LC3和anti-P62一抗過(guò)夜，加入二抗孵育1h，顯色劑顯色并封片。
　　（六）小鼠心梗模型構(gòu)建
　　BALB/c小鼠麻醉后氣管插管接呼吸機(jī)，潮氣量設(shè)置為3ml，呼吸頻率150次/分，吸呼比設(shè)置為2∶1，連接

7、模擬心電儀。消毒鋪巾，在左胸處剪開(kāi)約1cm長(zhǎng)的皮膚切口;鈍性分離皮下肌肉，暴露肋骨，延第四肋間隙剪開(kāi)肋間肌，進(jìn)入胸腔，用撐開(kāi)器撐開(kāi)肋骨，沿心底部剪開(kāi)心包，探查左心耳，使用8-0眼科帶針縫線，于左心耳下方2～3mm中外1/3進(jìn)針，左心耳右側(cè)外源出針，打結(jié)。結(jié)扎后心臟前壁局部顏色轉(zhuǎn)為蒼白，心電圖示ST段抬高。逐層關(guān)胸。
　?。ㄆ撸┝魇郊?xì)胞檢測(cè)
　　心肌細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理完畢后，應(yīng)用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，離心后用預(yù)冷的P

8、BS洗滌細(xì)胞兩次，再次離心后棄上清加入500μl的1×bindingbuffer再次懸浮細(xì)胞。加入5μ1 AnnexinⅤ-APC或AnnexinⅤ-FITC混勻后，室溫避光孵育15min。加入3μl PI混勻，避光孵育5min。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入上樣管進(jìn)行儀器檢測(cè)和分析。
　?。ò耍㏕UNEL和MASSON染色
　　心肌細(xì)胞凋亡是通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)，TUNEL染色主要通過(guò)凋亡檢測(cè)試劑盒來(lái)完成，具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書。在10個(gè)隨機(jī)的

9、高倍鏡視野下計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和心肌細(xì)胞總數(shù)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)的百分比定量心肌細(xì)胞凋亡率。利用Masson染色檢測(cè)心肌纖維化。Masson染色主要用masson染色試劑盒完成，具體步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書。
　?。ň牛╇p熒光素酶報(bào)告基因
　　將含有野生型和突變型p38α mRNA3'UTR的熒光素酶質(zhì)粒分別與miR-22類似物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后裂解293T細(xì)胞，分別檢測(cè)螢火蟲螢光素酶的活力和海腎熒

10、光素酶活性，計(jì)算兩者的比值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　（十）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用GraphPad Prism對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。以P＜0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬囸I誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬
　　使用EBSS饑餓處理4h后心肌細(xì)胞自噬水平顯著升高。Western blot提示饑餓4h時(shí)LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯升高，顯著高于

11、正常培養(yǎng)組，而P62水平則顯著低于正常培養(yǎng)組。免疫熒光檢測(cè)觀察到饑餓處理4h的心肌細(xì)胞內(nèi)的LC3紅色熒光小點(diǎn)聚集在細(xì)胞質(zhì)中，而熒光小點(diǎn)被視為自噬的標(biāo)志。這些結(jié)果說(shuō)明EBSS饑餓成功誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞發(fā)生自噬。定量PCR結(jié)果顯示與正常培養(yǎng)組相比，EBSS饑餓處理后miR-22的表達(dá)明顯下調(diào)，其中饑餓處理4小時(shí)miR-22下調(diào)最為明顯。
　?。ǘ﹎iR-22促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬
　　我們首先利用miR-22過(guò)表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染心

12、肌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)miR-22過(guò)表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-22腺病毒轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞中miR-22的表達(dá)量升高了14倍，說(shuō)明miR-22腺病毒的高效性。然后腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞48h后繼續(xù)用EBSS饑餓誘導(dǎo)自噬，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示miR-22過(guò)表達(dá)后LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值顯著提高，同時(shí)P62的水平明顯下降，免疫熒光檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)miR-22過(guò)表達(dá)后心肌細(xì)胞內(nèi)紅色熒光點(diǎn)的數(shù)量明顯增多。上述結(jié)果說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-22促進(jìn)了饑餓誘導(dǎo)

13、的心肌細(xì)胞自噬。此外小鼠心梗模型中miR-22過(guò)表達(dá)的心肌中LC3水平更高而P62水平更低，說(shuō)明miR-22過(guò)表達(dá)后心肌中的自噬水平也明顯升高。為進(jìn)一步從反面驗(yàn)證miR-22對(duì)自噬的影響，我們使用miR-22 inhibitor處理心肌細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-22 inhibitor轉(zhuǎn)染后miR-22被明顯下調(diào)。Western blot顯示下調(diào)miR-22的表達(dá)能顯著減少LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，但能增加P62的水平。免疫熒光檢

14、測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)miR-22下調(diào)后心肌細(xì)胞內(nèi)的紅色熒光點(diǎn)明顯減少。因此上述結(jié)果提示miR-22能提高饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬活性。
　　（三）miR-22抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　除了發(fā)生心肌細(xì)胞自噬，EBSS培養(yǎng)的心肌細(xì)胞也出現(xiàn)了明顯的凋亡。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在相同的饑餓條件下與對(duì)照組相比，miR-22過(guò)表達(dá)的心肌細(xì)胞發(fā)生更少的凋亡，表現(xiàn)出更低的凋亡率。為了研究?jī)?nèi)源性miR-22對(duì)于心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，我們同樣利用miR

15、-22 inhibitor敲低心肌細(xì)胞內(nèi)的miR-22的水平，同時(shí)以control inhibitor做為陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同的饑餓條件下與對(duì)照組相比，miR-22下調(diào)后的心肌細(xì)胞發(fā)生更明顯的凋亡，表現(xiàn)出更高的凋亡率。此外在小鼠心梗模型中，與對(duì)照組相比，miR-22過(guò)表達(dá)的心肌表現(xiàn)出更少的TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，說(shuō)明miR-22過(guò)表達(dá)后抑制了缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果說(shuō)明miR-22能抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。
　　

16、（四）miR-22通過(guò)抑制p38α表達(dá)調(diào)控心肌細(xì)胞自噬和凋亡。
　　我們利用生物學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)篩選miR-22在心肌細(xì)胞中的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)p38α是miR-22的潛在的靶基因。生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)p38α的3'UTR含有miR-22的可能的結(jié)合位點(diǎn)。因此我們首先利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證p38α是否是miR-22的靶基因。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-22可以抑制攜帶野生型p38α3'-UTR序列載體的螢火蟲熒光素酶活性，但對(duì)攜帶p38α3

17、'-UTR突變序列的載體的螢火蟲熒光素酶活性無(wú)影響，證實(shí)了p38α是miR-22的直接靶基因。Western blot也進(jìn)一步驗(yàn)證了在過(guò)表達(dá)miR-22后P38α蛋白的表達(dá)顯著受到抑制，而敲低miR-22后能促進(jìn)P38α蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果均提示miR-22可能通過(guò)靶向p38α對(duì)心肌細(xì)胞自噬和凋亡起調(diào)控作用。
　　結(jié)論:
　?。ㄒ唬〦BSS平衡鹽溶液饑餓處理心肌細(xì)胞能夠成功誘導(dǎo)離體的大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生自噬。
　?。ǘ┰?/p>

18、心肌細(xì)胞饑餓模型中，心肌細(xì)胞中miR-22的表達(dá)顯著下降，且在饑餓4h時(shí)下降最為明顯。
　?。ㄈ┻^(guò)表達(dá)miR-22能顯著促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，而敲低miR-22后則能抑制心肌細(xì)胞自噬的活性。
　?。ㄋ模┻^(guò)表達(dá)miR-22能顯著抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而敲低miR-22后則能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　?。ㄎ澹﹎iR-22靶向作用于p38α并直接抑制p38α的表達(dá)，并可能通過(guò)這條途徑促進(jìn)了饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自