真鯛肌肉中蛋白酶及其抑制劑的研究.pdf

1、蛋白酶及其內源性抑制劑在細胞和生物體的生命活動過程中起著十分重要的作用，在生產實踐中也具有廣泛的用途。魚類作為動物中最豐富的物種之一，為人類提供優(yōu)質蛋白質資源。魚類肌肉蛋白代謝和死后儲藏過程中的降解等生化變化與其內源性蛋白酶和抑制劑密切相關，而這些變化又直接影響魚肉的品質。因此，對魚類蛋白及其內源性抑制劑的研究具有重要的理論意義和潛在的應用價值。本文以海水魚真鯛為研究對象，對其肌肉中三種蛋白酶和一種內源性蛋白酶抑制劑進行了研究，為闡明魚

2、類肌肉蛋白新陳代謝機制、魚死后肌肉軟化機理等提供實驗依據和理論參考。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sephacet離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾、羥基磷灰石層析和Phenyl-Sepharose疏水層析等5步純化，首次從海水名貴魚真鯛肌肉中純化到一種亮氨酸氨肽酶(LAP)。LAP是一種結合Zn2+和(或)Mn2+的金屬蛋白酶，分子量為96 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和7.5。37℃下對熒光底物

3、Leu-MCA分解的米氏常數Km和Kcat值分別為1.55μmol/L和26.4 s-1，水解反應的活化能(Ea)為59.6kJ/mol。蛋白酶抑制劑Bestatin對LAP表現為競爭性抑制作用，抑制常數(K1)為1.44μmol/L。Zn2+和Cd2+對真鯛LAP的抑制作用類型均為混合型抑制，抑制常數(K1)分別為3.54 mmol/L和0.92mmol/L，對酶-底物絡合物的抑制常數(K1S)則分別為4.49 mmol/L和5.9

4、mmol/L。亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸對LAP的抑制均為競爭性抑制作用，其抑制常數(K1)分別為0.54、0.21和1.19 mmol/L；半胱氨酸對LAP為混合型抑制效應，抑制常數K1為0.26 mmol/L，對酶-底物絡合物的抑制常數K1S為9.43 mmol/L。利用制備的兔抗真鯛LAP多克隆抗血清進行免疫組化分析表明，LAP在真鯛肌肉細胞的胞質內主要呈點狀小顆粒樣分布，免疫學檢測表明在真鯛不同組織器官中廣泛分布有LAP。此外，L

5、AP在鯉魚、鯽魚、草魚、鰱魚、胡子鯰和藍園鲹等魚類肌肉中都有存在。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-Sephacei離子交換、Phenyl-Sepharose疏水層析和羥基磷灰石層析，從真鯛肌肉中純化到一種具有分解明膠能力的絲氨酸蛋白酶(SP)。SP的分子量為85 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和8.0。絲氨酸蛋白酶抑制劑可明顯抑制SP活性，其他類型蛋白酶抑制劑對其活性沒有明顯影響。該蛋白酶對熒光合成底物Boc-Leu-L

6、ys-Arg-MCA的米氏常數Km和Kcat值分別為3.58μmol/L和0.13s-1。實驗表明，SP與其它已報道的肌肉肌漿可溶性絲氨酸蛋白酶(MSSP)和肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)的酶學特性均有較明顯差異，可能是一種具有獨特酶學性質的新型絲氨酸蛋白酶。SP對明膠和真鯛Ⅰ型膠原蛋白具有明顯分解能力，對真鯛肌球蛋白重鏈也有明顯分解作用，推測其可能是參與魚肉保鮮過程肌肉軟化的一種重要蛋白酶。 通過硫酸銨沉淀、DEAE-

7、Sephacel離子交換層析、Phenyl-Sepharose疏水層析和Gelatin-Sepharose親和層析，從真鯛肌肉中純化到一種依賴鈣離子的金屬蛋白酶(MP)。MP的分子量為52 kDa，酶的最適溫度和最適pH分別為40℃和8.0，金屬蛋白酶抑制劑可明顯抑制其活性，其它蛋白酶抑制劑對MP活性則沒有抑制作用。MP活性完全依賴Ca2+的存在，性質分析顯示MP可能是一種類哺乳動物基質金屬蛋白酶。MP對明膠和真鯛Ⅰ型膠原蛋白具有較明顯

8、的分解作用，對真鯛肌原纖維蛋白如肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、α-輔肌動蛋白和伴肌動蛋白等具有明顯分解作用，推測其很可能是引起魚肉保鮮過程中肌肉軟化的主要蛋白酶之一。 利用分子克隆技術，從真鯛肌肉組織中克隆了類哺乳動物金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)編碼成熟蛋白區(qū)域的基因序列，該基因序列為585 bp，推導編碼194個氨基酸殘基，與來自真鯛囊胚細胞、牙鲆、斑馬魚、大西洋鮭魚和人TIMP-2氨基酸序列同源性分別為100％、91％、

9、80％、72％和70％，與人TIMP1，3和4的同源性均約為40％。通過基因工程技術，構建了重組酵母系統分泌性表達TIMP-2。在搖瓶培養(yǎng)狀態(tài)下，rTIMP-2表達水平可達10 mg/L，用Ni-NTA親和層析可一步高度純化rTIMP-2。rTIMP-2對真鯛和鯉魚肌肉肌漿金屬蛋白酶有抑制作用，對明膠酶A樣的基質金屬蛋白酶抑制作用明顯。 魚類肌肉中蛋白酶及其內源性抑制劑種類多樣，功能各異，它們共同參與肌肉蛋白新陳代謝和魚死后冷藏