BCR-ABL融合基因陽性B-ALL相關microRNAs篩選及其功能和作用機制初步研究.pdf

1、背景：
　　MicroRNAs(miRNAs)是長度為20-22個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，在真核生物細胞中廣泛表達，通過與靶基因mRNA結合誘導其降解或阻遏翻譯過程以調(diào)控靶基因表達。miRNA在細胞生長發(fā)育過程起著重要的作用，參與細胞的增殖、分化、凋亡等過程。miRNA還可以通過不同的調(diào)節(jié)途徑參與腫瘤的形成，其異常表達與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。近年來研究也表明，miRNA不僅在調(diào)節(jié)造血干/祖細胞增殖、分化及凋亡過程中

2、起著重要作用，還參與了白血病的發(fā)生與發(fā)展。
　　急性淋巴細胞白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是起源于淋巴細胞系（前體 B、T或成熟 B淋巴細胞）的惡性克隆性疾病，是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。兒童急性白血病中ALL約占80％，高發(fā)年齡段是2-5歲，成人急性白血病中ALL約占20%，高發(fā)年齡段是50歲以后，85%的兒童ALL與75%的成人ALL是B-ALL。隨著治療方案的不斷改善，B-ALL

3、的緩解率大大提高，兒童患者多數(shù)可以達到完全緩解。
　　BCR/ABL融合基因是由9號染色體上的原癌基因ABL，易位至22號染色體的BCR區(qū)，形成t(9;22)(q34;q11)，即BCR/ABL融合基因。它是B-ALL染色體異常的一種類型，稱為BCR/ABL融合基因陽性的 B-ALL。盡管隨著新技術和新藥物等診斷和治療方法應用于臨床，使得B-ALL的早期診斷和預后有了很大提高，但BCR/ABL融合基因陽性的B-ALL患者完全緩解困

4、難或完全緩解后易復發(fā)，該類患者預后差，死亡率高的情況仍未改善，3-5年的無病生存期（ disease-free survival，DFS）<10%，復發(fā)率高。因此針對BCR/ABL融合基因陽性B-ALL致病機制進行進一步深入研究，對其診療、預后判斷，甚至對靶向治療藥物的設計均有重要意義。雖然已有文獻報道參與BCR/ABL融合基因陽性的B-ALL的發(fā)生發(fā)展的重要基因和通路，但大多數(shù)集中于編碼基因編碼蛋白質(zhì)的分子網(wǎng)絡研究，對于非編碼基因mi

5、RNAs參與該類B-ALL的作用研究鮮見。
　　目的：
　　通過高通量深度測序及熒光定量PCR技術分析和發(fā)現(xiàn)BCR/ABL陽性B-ALL相關或特異miRNAs，初步明確其對該類高危急性白血病的作用性質(zhì)；生物信息學分析和尋找這些miRNAs關系密切的靶基因，為BCR/ABL陽性B-ALL發(fā)生發(fā)展的致病機制研究，以及診斷、治療、預后分析提供理論基礎和新的思路。
　　方法：
　　共收集139例住院患者的骨髓標本，其中初

6、診B-ALL患者68例為實驗組；初診CML患者7例，初診APL患者11例為疾病對照組；正常對照組患者53例。通過多重巢式PCR結合細胞學、免疫學及細胞遺傳學技術確診BCR/ABL陽性或陰性B-ALL及其他白血病；流式細胞分選BCR/ABL陽性及陰性B-ALL白血病細胞；提取總RNA，行miRNAs深度基因測序，篩選差異表達miRNAs；熒光定量PCR進行大臨床樣本的進一步驗證和發(fā)現(xiàn)BCR/ABL陽性B-ALL相關miRNAs；選取部分B

7、CR/ABL陽性B-ALL相關miRNAs，電轉(zhuǎn)染其模擬物至BCR/ABL陽性及陰性B-ALL白血病細胞株，CCK-8檢測這些相關miRNAs對BCR/ABL陽性B-ALL白血病細胞生長的影響，明確其初步的生物學功能；生物信息學分析和尋找這些相關miRNAs的靶基因，分析和探討其與BCR/ABL融合基因及其他基因的調(diào)控作用和結合位點。
　　結果：
　　1.BCR/ABL陽性B-ALL中存在差異性表達的miRNAs，這些miR

8、NAs在正常對照組及正常核型B-ALL中的表達水平亦存在差異。
　　2.BCR/ABL陽性B-ALL中差異性表達的miRNAs在不同類型的白血病中的表達水平也存在差異。
　　3.miR-183、4485、5008、5582等相關miRNAs在BCR/ABL陽性及陰性B-ALL細胞株中也存在差異性表達。
　　4.miR-183,4485、5008、5582等BCR/ABL陽性 B-ALL相關miRNAs在BCR/ABL陽

9、性B-ALL細胞株中的過表達可抑制BCR/ABL陽性B-ALL細胞增殖。
　　5.BCR/ABL陽性B-ALL相關miRNAs在BCR、ABL及BCR/ABL融合基因中可能存在直接作用靶點，從而直接或間接參與BCR/ABL陽性B-ALL的發(fā)生發(fā)展。
　　結論：
　　BCR/ABL陽性B-ALL存在低水平表達的miR-183、4485、5008、5582等miRNAs，這些BCR/ABL陽性B-ALL相關的miRNAs可