三氧化二砷對(duì)Bcr-Abl耐藥突變細(xì)胞株抑制作用及其作用機(jī)制.pdf

1、慢性粒細(xì)胞性白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）是一種多功能造血干細(xì)胞增殖異常引起的惡性克隆性疾病，CML發(fā)病率國(guó)外報(bào)道為1/10萬(wàn)，國(guó)內(nèi)為3.6/10萬(wàn)，全球年發(fā)病數(shù)約占成人白血病的15％，在成人白血病中排第三位，且具有增高趨勢(shì)。
　　 伊馬替尼（Imatinib，IM）是治療慢性期慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML-CP）最有效的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）。IM的臨床應(yīng)用，為CML的治療開辟了一條新的途徑。

2、盡管伊馬替尼可以使多數(shù)CML患者獲得較為持久的細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)，但在獲得最初的有效反應(yīng)之后，部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，這種現(xiàn)象在CML加速期、急變期和Ph+患者中尤甚。而Ab1激酶區(qū)域的點(diǎn)突變是引起IM治療失敗及復(fù)發(fā)的最主要原因。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先用臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察IM對(duì)各種Bcr-Ab1細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型的細(xì)胞對(duì)IM有敏感性，而其他含各種Bcr-Ab1點(diǎn)突變細(xì)胞對(duì)IM有一定的耐藥性，即為IM耐藥細(xì)胞株。因此，尋找其他

3、有效的治療藥物是臨床上急需解決的問題。
　　 三氧化二砷（ATO）治療急性早幼粒白血?。ˋPL）已取得很好的療效，并且作為一種多靶向藥物ATO在治療其他類型的白血病和實(shí)體瘤方面也取得了一定的療效。本實(shí)驗(yàn)將試圖研究三氧化二砷（ATO）對(duì)包括T3151點(diǎn)突變?cè)趦?nèi)的Bcr-Ab1突變細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用，并探討其作用機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察ATO對(duì)Bcr-Ab1野生型細(xì)胞株和伊馬替尼（IM）耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作

4、用。研究發(fā)現(xiàn)ATO對(duì)Bcr-Ab1野生型和IM耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用均呈現(xiàn)劑量依賴性，且含Bcr-Ab1點(diǎn)突變的耐藥細(xì)胞株對(duì)ATO格外敏感，其ATO的IC50值均比其對(duì)應(yīng)的Bcr-Ab1野生型細(xì)胞株低2.04～4.63倍。但無(wú)點(diǎn)突變的K562R細(xì)胞株的IC50值卻與野生型K562細(xì)胞的無(wú)顯著差異。
　　 95％的CML患者造血干細(xì)胞中存Bcr-Ab1融合基因，而Bcr-Ab1嵌合蛋白位于復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的中樞部位，其過度的酪氨酸激

5、酶活性使得其自身及其下游信號(hào)通路過度激活，從而抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用熒光定量PCR法檢測(cè)ATO作用于Bcr-Ab1野生型細(xì)胞株和伊馬替尼（IM）耐藥細(xì)胞株后，細(xì)胞內(nèi)Bcr-Ab1mRNA基因拷貝變化，并用Westernblot法檢測(cè)ATO處理后細(xì)胞內(nèi)Bcr-Ab1蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATO處理的兩種細(xì)胞Ber-Ab1mRNA無(wú)顯著變化（p>0.05），然而能下調(diào)Bcr-Ab1野生型細(xì)胞株細(xì)胞的Bcr-Ab1蛋白水平，而且對(duì)伊馬替尼（

6、IM）耐藥細(xì)胞株也有相同作用。鑒于Bcr-Ab1嵌合蛋白在CML發(fā)病過程中的重要作用，我們推測(cè)，ATO下調(diào)Bcr-Ab1蛋白的特殊機(jī)制可能是其作用于IM耐藥細(xì)胞株原因之一。
　　 通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法觀察到Bcr-Ab1野生型和含Bcr-Ab1點(diǎn)突變的耐藥細(xì)胞株對(duì)ATO敏感性存在差異，為了研究這種差異產(chǎn)生的原因，我們用DTNB比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量（GSH），結(jié)果顯示：含有Bcr-Ab1點(diǎn)突變的細(xì)胞株內(nèi)GSH含量顯著低于其對(duì)應(yīng)

7、的野生型細(xì)胞（p=0.00106～0.0358），而K562和K562R細(xì)胞中GSH含量無(wú)顯著差異（p=0.315）。并用AnnexinV&PI染色檢測(cè)用GSH生物合成抑制劑BSO處理各種細(xì)胞株后細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)BSO處理后細(xì)胞對(duì)ATO的敏感性均顯著增加。與Bcr-Ab1野生型細(xì)胞株相比，ATO對(duì)含有點(diǎn)突變的細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用更為顯著，這可能與細(xì)胞內(nèi)GSH的含量有關(guān)。但究競(jìng)是什么原因使得突變細(xì)胞內(nèi)GSH含量降低目前我們還不得而知，這