Tet調(diào)控BCR-ABL融合基因表達(dá)HL-60細(xì)胞系和小鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞性白血病(Chromc myelogenous leukemia,CML)最大的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)是存在特異性的Ph染色體，即9號染色體上的原癌基因c-abl和22號染色體的斷點(diǎn)集中區(qū)(bcr)易位形成分子量210KD的BCR-ABL融合蛋白(P210<'bcr-abl>)，轉(zhuǎn)錄活性受bcr啟動子控制，該蛋白具有異常增強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶活性(Proteintyrosine kinase，PTK)，并活化細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，從

2、而影響細(xì)胞的分裂與增殖、細(xì)胞凋亡、黏附等細(xì)胞生物學(xué)行為。為研究CML發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，人們一直在嘗試?yán)貌煌膯幼又苽銪CR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠模型。但多數(shù)BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠卻表現(xiàn)為急性淋巴細(xì)胞白血病，試驗(yàn)結(jié)果并不令人滿意，主要原因在于所采用的啟動子不能使P210<'bcr-abl>特異性的在造血干細(xì)胞和髓系細(xì)胞中特異性表達(dá)。 在CML患者體內(nèi)，BCRo-ABL，融合基因受bcr啟動子調(diào)控，但如果在轉(zhuǎn)基因小鼠中直接用bcr

3、啟動子控制P210<'bcr-abl>表達(dá)，會引起小鼠在胚胎期死亡。將四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)引入BCR-ABL，轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，控制P210<'bcr-abl>的表達(dá)時間和表達(dá)量，在小鼠出生后表達(dá)P210<'bcr-abl>，可避免因P210<'bcr-abl>表達(dá)而出現(xiàn)的胚胎毒性。Tet/Off系統(tǒng)誘導(dǎo)基因表達(dá)是通過撤除誘導(dǎo)劑來實(shí)現(xiàn)的，所以無法精確控制目的基因的表達(dá)量。而Tet-On誘導(dǎo)系統(tǒng)可通過添加不同濃度的誘導(dǎo)劑控制目的基的定時、定

4、量表達(dá)。在本研究中，利用Tet-On誘導(dǎo)系統(tǒng)定時定量的控制BCR-ABL，融合基因，在小鼠出生后誘導(dǎo)P210<'bcr-abl>表達(dá)，同時利用bcr啟動子特異控制Tet-On系統(tǒng)調(diào)控蛋白的表達(dá)，使P210<'bcr-abl>在小鼠造血干細(xì)胞和髓系血細(xì)胞中特異表達(dá)。通過受時空控制的P210<'bcr-abl>表達(dá)避免P210<'bcr-abl>的胚胎毒性，制備符合人CML慢性期疾病表現(xiàn)的BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠模型，用于CML發(fā)生、發(fā)展、

5、轉(zhuǎn)歸和干預(yù)的基礎(chǔ)和臨床研究。本研究首先克隆了1.1kb bcr啟動子，并利用報告基因EGFP對其在不同細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)錄活性作了初步研究，證實(shí)1.1kb bcr啟動子能在髓系血細(xì)胞中調(diào)控目的基因的表達(dá)，為利用bcr啟動子控制四環(huán)素調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)中的調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在成功克隆1.1Kb人bcr啟動子并證實(shí)其在髓系細(xì)胞中具有相對特異性表達(dá)特性的基礎(chǔ)上，我們構(gòu)建pbcrTet-On和pTRE2-BCR-ABL重組質(zhì)粒，試圖建立一個Te

6、t-on調(diào)控的、能在造血干細(xì)胞和髓系血細(xì)胞中特異性表達(dá)的BCR-ABL基因表達(dá)系統(tǒng)。用pbcrTet-On和pTRE2-BCR-ABL兩個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60，成功獲得Tet-On誘導(dǎo)特異性表達(dá)BCR．ABI，的HL-60細(xì)胞系。在此系統(tǒng)中，采用強(qiáng)力霉素DOX誘導(dǎo)bcr啟動子控制的調(diào)控蛋白rtTA在髓系血細(xì)胞中特異表達(dá)，以調(diào)控蛋白rtTA控制目_的基因BCR-ABL融合基因的表達(dá)水平。雙轉(zhuǎn)染陽性的HL-60細(xì)

7、胞中P210<'bcr-abl>的表達(dá)與DOX濃度存在量效關(guān)系。采用MTS/PMS法測定不同劑量DOX誘導(dǎo)P210<'bcr-abl>表達(dá)HL-60細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)其增殖能力較未轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞顯著增強(qiáng)。Annexin-V法測定DOX誘導(dǎo)P210<'bcr-abl>表達(dá)HL-60細(xì)胞的凋亡水平，發(fā)現(xiàn)雙轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)。進(jìn)一步以半定量RT-PCR方法研究bcl-2和bcl-xl mRNA相對量的變化，發(fā)現(xiàn)P210<'

8、bcr-abl>表達(dá)后引起B(yǎng)cl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，而Bcl-xl mRNA表達(dá)水平明顯增高。 Fet-on調(diào)控的、能在造血干細(xì)胞和髓系血細(xì)胞中特異性表達(dá)的BCR-ABL，基因表達(dá)系統(tǒng)的建立，為進(jìn)一步制備Tet-on調(diào)控的BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠創(chuàng)造了條件。我們將bcr-tet-On和TRE2-BCR-ABL基因元件顯微注射到ICRxC57BL/6雜交F1代鼠的雄原核中，共出生49只原代小鼠。PCR初篩后，以Southern