Rcan2兩種剪切變體的表達(dá)分布及其在體重調(diào)節(jié)中作用的研究.pdf

1、近幾十年，全球整體生活水平提高，體力活動減少而高能量食物攝入增多，全球超重和肥胖人口猛增。肥胖大大增加了糖尿病、心血管疾病等的發(fā)病幾率，嚴(yán)重危害人類健康，因此闡明體重調(diào)節(jié)機(jī)制和肥胖發(fā)生機(jī)理為控制“肥胖疫情”提供指導(dǎo)，成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的一個重要任務(wù)。
　　現(xiàn)在研究認(rèn)為體重受到“能量穩(wěn)態(tài)”機(jī)制的調(diào)控——脂肪細(xì)胞分泌的信號分子瘦素通過作用于下丘腦相關(guān)的信號通路雙向調(diào)控體重，肥胖是穩(wěn)態(tài)機(jī)制失調(diào)的結(jié)果，但該假說備受爭議。流行病學(xué)研究表明

2、，體重受遺傳因素與環(huán)境因素的共同影響，食物過剩及高能量食物盛行是引發(fā)肥胖的主要環(huán)境因素。
　　近年研究發(fā)現(xiàn)，Rcan2基因以一種與瘦素?zé)o關(guān)的機(jī)制增加攝食、促進(jìn)體重增長，當(dāng)Rcan2與高脂肪食物共存時引起小鼠體重加速增長，這一發(fā)現(xiàn)可為解釋肥胖和高能量食物的關(guān)系、揭示肥胖爆發(fā)的成因提供一定的科學(xué)證據(jù)。Rcan2編碼兩種轉(zhuǎn)錄起始位點不同的剪切變體Rcan2-1、Rcan2-3，之前的研究利用同源重組的方法，將LacZ元件替換二者共用的4

3、號外顯子，制作了Rcan2敲除（Rcan2-/-）小鼠，一方面該小鼠用于基因功能的研究，另一方面，插入的LacZ元件可與Rcan2-1、Rcan2-3各自轉(zhuǎn)錄起始位點所在的外顯子一起轉(zhuǎn)錄翻譯成具有β-半乳糖苷酶活性的Rcan2-1-LacZ、Rcan2-3-LacZ融合蛋白，利用X-Gal染色即可原位檢測Rcan2的表達(dá)分布情況。然而兩種剪切變體各自在體重調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用以及表達(dá)分布情況尚不明確，而這正是本論文要解決的核心問題。

4、>　　在本研究中，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作了Rcan2-1敲除小鼠（Rcan2-1-/-，2號外顯子上ATG后缺失1個脫氧核苷酸T導(dǎo)致Rcan2-1移碼突變）、Rcan2-3敲除小鼠（Rcan2-3-/-，3號外顯子上ATG后缺失2個脫氧核苷酸AG導(dǎo)致Rcan2-3的移碼突變），經(jīng)傳代和雜合小鼠雌雄交配得到了純合敲除小鼠。4周齡起，將同窩的野生型小鼠分別與兩種純合敲除小鼠組合進(jìn)行為期16周的體重監(jiān)測實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高脂肪

5、食物喂養(yǎng)下，Rcan2-3-/-小鼠體重較野生型小鼠稍輕，至20周齡時，二者的脂肪、肝臟等組織重量沒有統(tǒng)計學(xué)差異，脂肪等的組織形態(tài)學(xué)相似且均具有肥胖特征;而Rcan2-1-/-與野生型小鼠組中，4周齡至5周齡，二者體重曲線基本吻合，從6周齡開始二者體重逐漸拉開差距，野生型小鼠的體重增長明顯加快，20周齡時二者體重差接近7g，野生型小鼠的脂肪等的組織形態(tài)呈現(xiàn)肥胖特征，而敲除小鼠相關(guān)組織的形態(tài)沒有異常。上述結(jié)果表明在體重調(diào)節(jié)中起主要作用的可

6、能是Rcan2-1。
　　我們將特異性靶向Rcan2-1、Rcan2-3的CRISPR/Cas9打靶載體分別注射到Rcan2雜合敲除（Rcan2+/-）受精卵中，當(dāng)Rcan2-3靶點處的無義突變發(fā)生于帶LacZ的染色體DNA上時，Rcan2-3-LacZ融合蛋白失活，這樣得到了僅保留Rcan2-1-LacZ融合蛋白的小鼠，該小鼠的X-Gal染色結(jié)果原位顯示了Rcan2-1的表達(dá)分布位置，同理可得Rcan2-1-LacZ缺失而僅能檢

7、測Rcan2-3表達(dá)分布情況的小鼠。實驗結(jié)果表明，Rcan2-3在胚胎和成體中的表達(dá)部位與Rcan2-/-小鼠的結(jié)果基本重合，在胚胎期9.5(E9.5)天時Rcan2-3已表達(dá)，E11.5至E12.5天時Rcan2-3主要分布于端腦泡、中后腦交界處、后腦、延髓、脊髓，E13.5天時其分布范圍擴(kuò)展至中腦、間腦，隨著發(fā)育進(jìn)行Rcan2-3在胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)范圍逐漸擴(kuò)大，在成體中Rcan2-3集中分布于腦、脊髓且在PVN等神經(jīng)核團(tuán)有突出

8、表達(dá);而Rcan2-1表達(dá)較晚、表達(dá)量較少，胚胎E15.5天時檢測到前腦區(qū)有微弱表達(dá)，在成體腦中僅丘腦、大腦皮層部分區(qū)域有一定分布。
　　此外，為了進(jìn)一步證明Rcan2-1、Rcan2-3在肥胖發(fā)生中的功能，我們擬利用To12轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)制作帶有FLAG標(biāo)簽的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)Rcan2-1FLAG小鼠和Rcan2-3FLAG小鼠。F0代得到了隨機(jī)插入Rcan2-1-FLAG、Rcan2-3-FLAG片段且能夠穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因小鼠，然而W

9、estern blot實驗結(jié)果顯示，上述小鼠的腦等組織中均未檢測到FLAG目的蛋白，推測可能與轉(zhuǎn)基因位置效應(yīng)等因素有關(guān)。
　　本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作了Rcan2-1、Rcan2-3分別敲除的小鼠模型，體重監(jiān)測實驗顯示，Rcan2-1而非Rcan2-3的缺失明顯地減弱了高脂肪食物引發(fā)的肥胖，由此確定了Rcan2-1在體重調(diào)節(jié)中的主要作用，并首次利用組織化學(xué)方法直觀地展示了蛋白水平上Rcan2兩種剪切變體在小鼠胚胎和