2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本課題進行了以下幾個方面的研究: 第一部分CR和Res對人類SIRT1基因表達的影響 在低等生物和體外實驗中發(fā)現(xiàn)CR通過激活Sir2來發(fā)揮延長壽命的作用,而Res是Sirtuin激活復(fù)合物(Sirtuin activating compounds,STACs),我們本部分實驗工作中分析了CR和Res對人類SIRT1基因轉(zhuǎn)錄的作用。 我們選擇了四種不同的人類細胞株,即HEK293,U2OS,HeLa和HepG

2、2細胞,通過在培養(yǎng)過程中撤出血清或添加Res,培養(yǎng)12h后收集細胞,采用RT-PCR以及實時定量RT-PCR的方法,分析人類SIRT1基因mRNA水平。 結(jié)果發(fā)現(xiàn): 1.對數(shù)生長期的人類HEK293和HeLa細胞經(jīng)CR處理后,其SIRT1基因mRNA水平明顯高于對照,其升高幅度接近3倍; 2.在培養(yǎng)基中加入20μM Rcs能顯著增加人類HepG2細胞和HeLa細胞SIRT1基因mRNA水平,其升高幅度接近3

3、倍; 3.Res增強SIRT1基因轉(zhuǎn)錄在一定濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴性。 以上研究結(jié)果表明CR和Res均能增強人類SIRT1基因轉(zhuǎn)錄,不同細胞具有類似的作用提示二者激活SIRT1基因轉(zhuǎn)錄作用無組織細胞特異性。這一研究結(jié)果為Res與CR在壽命調(diào)節(jié)中具有相同作用機制這一觀點提供了直接的實驗證據(jù)。 由于mRNA水平的升高主要通過促進轉(zhuǎn)錄啟始活性而實現(xiàn),DNA順式作用元件是涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的重要因素之一,是基因表達調(diào)

4、控的重要研究內(nèi)容。因此為進一步闡釋CR和Res調(diào)控SIRT1表達的作用機制,定位其發(fā)揮作用的靶位點,我們著手對SIRT1基因的啟動區(qū)進行分析。 第二部分人類SIRT1基因基本啟動子分析 研究SIRT1基因表達的調(diào)控機制對于理解該基因的功能十分重要,目前關(guān)于SIRTl基因的表達調(diào)控機制尚不清楚。在本部分的實驗工作中,我們對SIRT1基因的基本啟動子進行了分析,為進一步分析外界因素對SIRT1基因的表達調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

5、 首先采用MatInspector軟件對NCBI數(shù)據(jù)庫提供的人類SIRT1基因5’上游約1Kb序列進行分析,篩選順式作用元件。根據(jù)基因組序列設(shè)計引物,利用不含啟動子和增強子的報告基因分析系統(tǒng)pGL3-basic載體,將人類SIRT1基因編碼序列上游1 Kb范圍內(nèi)的系列截短片段分別克隆到pGl3-basic載體報告基因上游,以檢測待測片段的啟動子活性。取得了如下結(jié)果: 1.軟件分析發(fā)現(xiàn)人類SIRTl基因缺乏典型的TAT

6、A box和CAATbox啟動子序列,但具有NF-KB,Sp1,AP2和CREB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在轉(zhuǎn)錄起始位點約300bp范圍內(nèi)包含一個富含GC的區(qū)域,GC含量約為70﹪。 2.對載體P-883檢測發(fā)現(xiàn)具有較強的啟動子活性,表明人類SIRTl基因轉(zhuǎn)錄起始點上游883bp區(qū)域內(nèi)含有該基因的啟動調(diào)控序列。 3.經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始點上游-883bp至-243bp區(qū)域內(nèi)不存在較強的正性或負性調(diào)控元件而表達載體P-60與載

7、體P-243相比較,其熒光素酶表達活性明顯降低,降低幅度達到8倍,表明該區(qū)域內(nèi)存在著人類SIRTl基因的主要表達調(diào)控元件。兩種細胞中報告基因表達趨勢相同,提示不存在組織特異性。5’缺失分析進一步將候選區(qū)域縮小到-86bp至-60bp之間和-182bp至-111bp之間。 4.-86bp至-60bp之間存在三個串聯(lián)排列的Spl結(jié)合位點,提示Spl在人類SIRTl基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控上起重要作用,突變分析證實3個Spl位點中遠離轉(zhuǎn)錄起始點

8、的Spl位點起決定性作用,該位點突變導(dǎo)致啟動子活性明顯下降,突變其它兩個Spl位點對啟動子的轉(zhuǎn)錄活性無顯著影響;抑制內(nèi)源性Spl表達降低了細胞SIRTl基因mRNA水平和啟動子活性;EMSA分析表明Spl位點能特異性結(jié)合Spl蛋白。這些研究結(jié)果表明該區(qū)域的Spl位點是維持人類SIRTl基因轉(zhuǎn)錄所必需的重要調(diào)控元件。 5.-182bp至-111bp區(qū)域內(nèi)存在一個p53結(jié)合模序,缺失和突變分析結(jié)果表明該序列在維持人類SIRTl基因

9、的基本啟動子活性上也發(fā)揮著重要作用。蛋白質(zhì)相互作用分析進一步證實了人類SIRTl基因為p53蛋白的靶基因。此項研究結(jié)果提示p53蛋白與SIRTl之間具有著密切的調(diào)節(jié)機制。 第三部分p53在CR上調(diào)人類SIRTl基因表達中的作用 我們在第一部分實驗中發(fā)現(xiàn)CR和Res明顯提高了SIRTl基因的mRNA水平,兩者參入SIRTl基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。通過第二部分的實驗研究在SIRTl基因啟動調(diào)控區(qū)鑒定到一個功能性p53反應(yīng)元件

10、,提示人類SIRTl基因為p53蛋白的靶基因。對小鼠Sirtl基因的研究發(fā)現(xiàn),CR上調(diào)小鼠Sirtl基因表達是通過其啟動子區(qū)域p53結(jié)合位點介導(dǎo)的。序列比對分析發(fā)現(xiàn)人類SIRTl基因與小鼠Sirtl基因不同,其對應(yīng)區(qū)域只存在一個p53反應(yīng)元件的half site,而小鼠則是由兩個halfsites構(gòu)成的一個完整的反應(yīng)元件。為明確CR調(diào)控人類SIRT1基因表達的靶位點,我們對p53在CR調(diào)控人類SIRT1基因表達中所發(fā)揮的作用進行了深入分

11、析。我們選擇了兩組不同來源的p53陽性和p53陰性細胞株,分別為:成骨細胞來源的U2OS、Saos-2細胞株,和肝臟來源的HepG2、Hep3B細胞株。利用前述構(gòu)建的含有p53結(jié)合序列的熒光素酶表達載體P-158、缺失該結(jié)合序列的熒光素酶表達載體P-111以及突變型載體P-158-p53(mut)分別瞬時轉(zhuǎn)染U2OS和HepG2細胞,CR處理24 h后收集細胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)定量分析被檢測片斷的啟動子活性。同時利用共轉(zhuǎn)染

12、野生型p53表達載體到p53陰性細胞株Saos-2、Hep3B細胞株的研究深入分析了內(nèi)源性和外源性p53對CR上調(diào)SIRT1表達的影響。結(jié)果如下: 1.在表達野生型p53的HepG2和U2OS細胞中,CR能顯著升高人類SIRT1基因mRNA水平,但在不表達p53的Hep3B和Saos-2細胞,CR對SIRT1基因的轉(zhuǎn)錄無顯著作用,提示CR上調(diào)SIRT1基因轉(zhuǎn)錄需要p53的作用; 2.經(jīng)CR處理后,表達載體P-158的

13、熒光素酶相對表達活性顯著升高,表明該區(qū)段內(nèi)包含有CR發(fā)揮作用的DNA反應(yīng)元件;而缺失p53結(jié)合序列的表達載體P-111以及突變型表達載體P-158-p53(rout),在CR處理和正常培養(yǎng)的對照條件下,其熒光素酶的相對表達活性沒有明顯變化,說明人類SIRT1基因啟動子區(qū)域-158bp至-111bp之間的p53結(jié)合模序是CR上調(diào)SIRT1基因啟動活性的調(diào)控元件。 3.在p53陰性細胞系Saos-2和Hep3B細胞中,CR處理和正

14、常培養(yǎng)的對照條件下,表達載體P-158和P-111熒光素酶的相對表達活性沒有明顯變化。說明CR上調(diào)人類SIRT1基因轉(zhuǎn)錄需要p53和該基因啟動子區(qū)域-158bp至-111bp之間的p53結(jié)合序列同時存在。 4.共轉(zhuǎn)染野生型p53表達載體到p53陰性細胞能恢復(fù)CR對SIRT1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。 這些結(jié)果表明CR上調(diào)人類SIRTl基因轉(zhuǎn)錄是p53依賴性的,盡管人類SIRT1基因啟動子區(qū)域只有1個half site,但也

15、能發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。這是首次在細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)p53的half site能與p53特異結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用,從而進一步拓展了對p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的認識。第四部分FOXO3a在CR調(diào)控人類SIRT1基因表達中的作用我們在前期研究的基礎(chǔ)上,進一步探討了CR調(diào)控人類SIRT1基因所涉及的關(guān)鍵信號通路因子。有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXO家族和Sir2共同參與壽命的調(diào)節(jié)。人類FOXO家族位于Akt/PKB的下游,在胰島素信號傳遞中發(fā)揮著關(guān)鍵

16、性作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXO是哺乳動物中Sirtl的直接和功能性的調(diào)控靶點,其可逆性乙酰化作用影響其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。有報道發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中,CR以FOXO3a依賴方式,提高小鼠Sirt1的轉(zhuǎn)錄水平。鑒于FOXO在介導(dǎo)CR調(diào)控Sirtl表達,以及其在抗癌、抗心血管疾病相關(guān)基因表達調(diào)控中所發(fā)揮的重要作用,我們采用RT-PCR,以及siRNA抑制內(nèi)源性FOX03a基因表達的方法進一步對FOXO家族成員在CR激活人類SIRT1轉(zhuǎn)錄過程中所發(fā)揮的作

17、用進行了分析。 研究發(fā)現(xiàn)CR對人類SIRT1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用為FOXO3a依賴性的,CR顯著增強了FOXO3a基因的mRNA表達水平,并促進FOXO3a靶效應(yīng)蛋白的表達;利用siRNA技術(shù)抑制內(nèi)源性FOXO3a基因的表達,明顯削弱了CR對SIRT1基因mRNA水平的上調(diào)效應(yīng)以及對SIRT1基因啟動區(qū)表達的激活作用。 本研究深入探討了SIRT1基因的表達調(diào)控機制,為闡釋壽命調(diào)節(jié)機制奠定了基礎(chǔ),為探索延長壽命的基礎(chǔ)研究

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