SIRT1調(diào)控Wnt信號(hào)通路影響間充質(zhì)干細(xì)胞成脂定向的機(jī)制.pdf

1、動(dòng)物脂肪組織的沉積不僅僅是增加已存在的脂肪細(xì)胞中的脂類(lèi)儲(chǔ)藏，而且始終伴隨著從祖細(xì)胞生成新的脂肪細(xì)胞的過(guò)程，即“脂肪生成(adipogenesis)”。脂肪生成包括起始階段多能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞“定型”，以及隨后前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞“分化”。在過(guò)去的二十年中，人們對(duì)調(diào)控脂肪生成的調(diào)網(wǎng)絡(luò)，特別是控制前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞“分化”的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)已經(jīng)基本清楚。而在“定型”階段，雖然目前已有一些轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路也陸續(xù)被證實(shí)，但由于缺少前脂肪細(xì)胞的

2、標(biāo)志基因，因此，多能的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)向前脂肪細(xì)胞“定型”的特異性定型因子及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　已有研究證實(shí)，SIRT1在前脂肪細(xì)胞分化中，不僅可以去乙?；M蛋白，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性;而且可以去乙酰化脂肪生成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。此外，在MSCs細(xì)胞命運(yùn)決定中，SIRT1可以促進(jìn)MSCs的成骨分化，而抑制MSCs的成脂分化。但SIRT1調(diào)控MSCs成脂定向的分子機(jī)制尚不明確

3、，有待進(jìn)一步闡明。
　　本研究由兩部分組成，第一部分為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究SIRT1通過(guò)Wnt信號(hào)通路的對(duì)MSCs細(xì)胞成脂定向的影響，并闡明SIRT1通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，影響MSCs分化形成脂肪細(xì)胞的分子機(jī)制。第二部分為體內(nèi)活體試驗(yàn)，以SIRT1敲除的小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)動(dòng)物活體驗(yàn)證SIRT1與脂肪形成的關(guān)系;同時(shí)以分離的小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（mouseembryonicfibroblasts，MEFs）為材料，進(jìn)一步探討了SI

4、RT1調(diào)控MSCs成脂定向的分子機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　第一部分，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在C3H10T1/2細(xì)胞中，對(duì)SIRT1用激活劑或抑制劑處理，或干涉/過(guò)表達(dá)SIRT1后，研究SIRT1對(duì)脂肪生成表型及成脂標(biāo)志基因mRNA和蛋白水平的影響。在此基礎(chǔ)上，研究干涉SIRT1對(duì)Wnt信號(hào)靶基因和關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及Wnt信號(hào)通路報(bào)告系統(tǒng)活性的影響;用Real-timePCR芯片篩選出受SIRT1調(diào)控Wnt信號(hào)通路拮抗物;并穩(wěn)定干涉

5、這些Wnt信號(hào)通路拮抗物后，研究對(duì)成脂表型及成脂標(biāo)志基因mRNA和蛋白水平的影響;通過(guò)ChIP和IP等手段，研究SIRT1調(diào)控Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.添加SIRT1的激活劑白藜蘆醇抑制了C3H10T1/2細(xì)胞的成脂表型，且成脂標(biāo)志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達(dá)也顯著抑制;而添加SIRT1的抑制劑煙酰胺則促進(jìn)了C3H10T1/2細(xì)胞的脂滴形成，成脂標(biāo)志基因(PPARγ

6、，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達(dá)豐度顯著上調(diào)(P＜0.05)。白藜蘆醇處理顯著增加了6h和12h的S期細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05），煙酰胺處理對(duì)細(xì)胞周期影響不顯著(P＞0.05)。
　　2.在C3H10T1/2細(xì)胞中干涉SIRT1，成脂誘導(dǎo)后，增加了油紅O染色的脂滴的數(shù)目，且顯著提高了成脂標(biāo)志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達(dá)豐度;而過(guò)表達(dá)SIRT1組，視野中油紅O染色的脂滴較

7、少，顯著抑制了成脂標(biāo)志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白表達(dá)。表明激活SIRT1抑制了MSCs細(xì)胞的成脂定向;而抑制SIRT1的活性，則促進(jìn)了MSCs細(xì)胞的成脂定向。
　　3.在C3H10T1/2細(xì)胞中干涉SIRT1，顯著抑制了Wnt信號(hào)通路靶基因CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P＜0.05)以及Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵分子β-catenin的蛋白水平;Wnt信號(hào)通路報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干涉S

8、IRT1顯著抑制了Wnt信號(hào)通路報(bào)告系統(tǒng)的活性(P＜0.05);此外，通過(guò)轉(zhuǎn)染β-catenin的突變體質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控是依賴(lài)β-catenin的。
　　4.Wnt信號(hào)PCR芯片結(jié)果及對(duì)芯片的驗(yàn)證結(jié)果顯示，激活SIRT1顯著抑制了Wnt信號(hào)通路胞外拮抗物sFRP1和sFRP2以及胞內(nèi)拮抗物Dact1的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05);而抑制SIRT1顯著提高了Wnt信號(hào)通路胞外拮抗物sFRP1和sFR

9、P2以及胞內(nèi)拮抗物Dact1的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)。這表明，SIRT1對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控可能是通過(guò)Wnt信號(hào)的胞外拮抗物sFRP1和sFRP2，以及Wnt信號(hào)的胞內(nèi)拮抗物Dact1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　5.分別建立穩(wěn)轉(zhuǎn)干涉SIRT1和干涉Wnt信號(hào)通路拮抗物的細(xì)胞材料:pLKO.1-SIRT1、pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1、pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP2,pLKO.1-SIRT1

10、+pLKO.1-Dact和pLKO.1-SIRT1+pLKO.1-sFRP1+pLKO.1-sFRP2;成脂誘導(dǎo)這些穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞，結(jié)果顯示與pLKO.1-SIRT1組相比，這些細(xì)胞的形成的脂滴較少，且成脂標(biāo)志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào);Wnt信號(hào)通路報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pLKO.1-SIRT1組相比，提高了Wnt信號(hào)通路的活性。以上結(jié)果表明，在MSCs細(xì)胞成脂定向過(guò)程中，SIRT1可能

11、通過(guò)Wnt信號(hào)拮抗物sFRP1、sFRP2和Dact1來(lái)作用的。
　　6.ChIP結(jié)果顯示，干涉SIRT1顯著增加了sFRP1、sFRP2和Dact1的啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白的H3K9和H4K16的乙酰化水平(P＜0.05)。此外，IP結(jié)果顯示，干涉SIRT1顯著增加了β-catenin的乙酰化水平，且減少了β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的水平。這表明，SIRT1可以通過(guò)去乙?；M蛋白和非組蛋白兩種方式調(diào)控Wnt信號(hào)通路。
　　

12、第二部分，體內(nèi)活體實(shí)驗(yàn)。首先，以SIRT1單敲的小鼠（SIRT1+/-）為研究對(duì)象，SIRT1野生型小鼠（SIRT1+/+）為對(duì)照，驗(yàn)證SIRT1與脂肪形成的關(guān)系。正常飲食飼喂12w后，對(duì)小鼠稱(chēng)重并取樣，對(duì)各部位脂肪組織和肝臟稱(chēng)重，并計(jì)算脂肪組織與體重的比值;檢測(cè)血液中甘油三酯的含量;通過(guò)外觀(guān)和HE染色觀(guān)察脂肪組織的形態(tài);并檢測(cè)了皮下和內(nèi)臟脂肪組織中成脂標(biāo)志基因的變化。然后，分離13.5的小鼠胚胎的MEFs細(xì)胞，經(jīng)基因型鑒定后，對(duì)不同S

13、IRT1基因型（SIRT1+/+、SIRT1+/-和SIRT1-/-）的MEFs細(xì)胞成脂誘導(dǎo)，研究SIRT1對(duì)脂肪生成表型及成脂標(biāo)志基因mRNA和蛋白水平的影響;此外，以不同SIRT1基因型的MEFs細(xì)胞為材料，通過(guò)ChIP和IP等手段進(jìn)一步探討SIRT1調(diào)控Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.小鼠正常飲食飼喂12w后，SIRT1+/-小鼠的外觀(guān)正常，但體重顯著低于SIRT1+/+小鼠(P＜0.05);脂肪組織和肝臟

14、質(zhì)量沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但提高了SIRT1+/-小鼠的脂肪與體重質(zhì)量比(P＜0.05);血液中甘油三酯的含量也沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果表明，SIRT1敲除影響了小鼠生長(zhǎng)，但并不影響脂肪組織和肝臟組織的發(fā)育，相反可以促進(jìn)脂肪的形成。
　　2.對(duì)脂肪組織的形態(tài)研究結(jié)果顯示，不同基因型小鼠的棕色脂肪組織和附睪脂肪組織外觀(guān)差異不顯著;HE染色結(jié)果顯示，SIRT1+/-小鼠脂肪組織脂肪細(xì)胞的體積有增加的趨勢(shì)。

15、　　3.SIRT1+/-小鼠顯著提高了皮下脂肪（腹股溝脂肪）中PPARγ的mRNA表達(dá)豐度(P＜0.05)，對(duì)內(nèi)臟脂肪（附睪脂肪）中PPARγ的mRNA表達(dá)沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）;aP2和adiponectin的mRNA在兩種基因型小鼠的皮下和內(nèi)臟脂肪組織中的表達(dá)也沒(méi)有差異。
　　4.成脂誘導(dǎo)MEFs細(xì)胞后，SIRT1+/-和SIRT1-/-組的MEFs細(xì)胞脂滴數(shù)目較多，而SIRT1+/-組最多;SIRT1+/-組的成脂標(biāo)志

16、基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的表達(dá)豐度極顯著或顯著高于SIRT1+/+和SIRT1-/-組(P＜0.01;P＜0.05);而SIRT1-/-組的成脂標(biāo)志基因(PPARγ，aP2和adiponectin)的表達(dá)豐度極顯著高于SIRT1+/+(P＜0.01)。以上結(jié)果表明，SIRT1缺失則促進(jìn)了MEFs細(xì)胞的脂肪生成，SIRT1單缺失具有更強(qiáng)的成脂能力。
　　5.ChIP結(jié)果顯示，在SIRT1缺失的MEFs細(xì)胞中

17、，顯著增加了sFRP1、sFRP2和Dact1的啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白的H3K9和H4K16的乙?；?P＜0.05)。IP結(jié)果顯示，干涉SIRT1缺失增加了β-catenin的乙?；?。這表明在SIRT1缺失的MEFs細(xì)胞中，SIRT1也可以通過(guò)去乙?；M蛋白和非組蛋白兩種方式調(diào)控Wnt信號(hào)路。
　　本研究的主要結(jié)論:
　　SIRT1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞命運(yùn)選擇具有決定性作用，激活SIRT1抑制了MSCs細(xì)胞的成脂定向，而抑制S