水稻RACK1基因（OsRACK1）在鹽脅迫響應(yīng)中的功能研究.pdf

1、RACK1蛋白屬于一類含有WD-40重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白家族的亞家族。WD-40重復(fù)蛋白是一類大的蛋白質(zhì)家族，結(jié)構(gòu)高度保守，廣泛分布于真核生物和原核生物中，目前已鑒定到140多種蛋白屬于WD-40重復(fù)蛋白家族。這類蛋白在多種生物生命活動過程中扮演非常重要的角色，如細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運、細(xì)胞骨架的組裝和解聚、RNA的加工、染色質(zhì)的修飾及轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂、胞漿移動、細(xì)胞凋亡、光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞運動、開花、花序的發(fā)育以及分生組織的形成等。每個WD重復(fù)結(jié)

2、構(gòu)域包含40-60個氨基酸，WD結(jié)構(gòu)域的N端一般是由GIy-His(GH)二肽組成的11到24個氨基酸殘基，它的C端含有Trp-Asp(WD)二肽。最初RACK1蛋白被確定為蛋白激酶C(PKC)的受體，現(xiàn)在認(rèn)為RACK1蛋白作為支架蛋白在多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用。 已有研究結(jié)果表明，擬南芥AtRACK1參與了植物對滲透脅迫信號的響應(yīng)過程，并且與植物忍耐滲透脅迫密切相關(guān)。以AtRACK1蛋白的氨基酸序列為模板對水稻基因組序列進(jìn)

3、行比對，我們找到兩個與編碼AtRACK1蛋白高度同源的基因。在蛋白質(zhì)水平兩者與AtRACK1蛋白的同一性和相似性分別達(dá)到70％和80％。推測水稻的RACK1(OsRACK1)可能與擬南芥RACK1(AtRACK1)具有相似的功能。 本研究以粳稻日本晴為研究材料，首先通過RT-PCR技術(shù)及T-A克隆法克隆了編碼RACK1蛋白(NP-916988)的基因OsRACK1，并構(gòu)建了OsRACK1基因的過表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，再通過

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入水稻并篩選出OsRACK1基因過表達(dá)和RNAi OsRACK1基因片段抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)一步深入研究了OsRACK1基因在鹽脅迫響應(yīng)中的功能。主要結(jié)果如下： 1 提取水稻總RNA，并對其完整性進(jìn)行了檢測。 2 RT法反轉(zhuǎn)錄合成了完整的OsRACK1基因的cDNA第一鏈，并以此為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增了雙鏈OsRACK1的基因。序列分析表明，OsRACK，基因的大小為1199bp，包含了

5、基因完整的編碼序列，且與已發(fā)表的基因全序列完全相同，同源性達(dá)100％。 3 構(gòu)建了帶有由35S啟動子控制的GUS基因的水稻OsRACK1基因的過表達(dá)載體和RNAi表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入粳稻日本晴基因組中。 4 通過GUS染色進(jìn)行初步的檢測，然后對陽性植株進(jìn)行基因組DNA PCR法鑒定，再用Southern blot對目的基因的真實性和拷貝數(shù)進(jìn)行檢測，最后通過RQ-PCR對OsRACK1基因的表達(dá)

6、量進(jìn)行鑒定獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株。 5 應(yīng)用RACK1過表達(dá)(OX-2)和抑制表達(dá)(R-2)的轉(zhuǎn)基因植株T1代種子進(jìn)行的萌發(fā)試驗及相關(guān)生理生化指標(biāo)分析結(jié)果表明，在鹽脅迫條件下OX-2種子萌發(fā)要快于對照和R-2種子的萌發(fā)； OX-2種子的根長、根數(shù)及芽長同樣高于對照和R-2的；而且前者的可溶性糖的含量也較高，但可溶性蛋白和ABA含量低于對照與R-2的。表明RACK1過表達(dá)促進(jìn)了鹽脅迫條件下的種子萌發(fā)。 6 對相關(guān)轉(zhuǎn)基因幼苗在

7、鹽脅迫條件下的生理分析結(jié)果表明，與對照(非轉(zhuǎn)基因水稻)相比，在同樣程度的鹽脅迫條件下，RACK1過表達(dá)幼苗的相對含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量、氧化酶的活性和ABA含量均低于對照和R-2幼苗，而MDA含量和電導(dǎo)率高于對照和R-2植株。由此推測OsRACKl蛋白對幼苗耐鹽性具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。 7 對OsRACK，基因在調(diào)節(jié)植株耐鹽性生理與分子機(jī)理的進(jìn)一步研究結(jié)果表明，OsRACK1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗無論根還是葉的KJNa比均低于對照

8、和OsRACK1，表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因幼苗，而OsRACK1表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因幼苗根系對K的吸收和運輸均大于對照和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因幼苗。在鹽脅迫下，OsRACK1表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因幼苗內(nèi)源ABA的含量顯著高于OsRACK1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因幼苗和對照。與無鹽脅迫處理相比，鹽脅迫處理顯著促進(jìn)了DREB1和P5CS的表達(dá)，但各基因型間差異不明顯。外源ABA處理顯著促進(jìn)了P5CS的表達(dá)，但對DREB1的表達(dá)無作用。RACK1基因的表達(dá)不受鹽脅迫和外源A