水稻RACK1基因(OsRACK1)在種子萌發(fā)進(jìn)程中的功能研究.pdf

1、RACK1蛋白編碼基因最早在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，后來在許多真核生物中都發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物RACK1基因的同源基因。哺乳動(dòng)物RACK1是一種支架蛋白，并可以與許多信號(hào)分子相互作用調(diào)節(jié)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。植物細(xì)胞中RACK1蛋白的功能相對(duì)研究較少，目前還不能確定是否與動(dòng)物RACK1一樣發(fā)揮支架作用，但由于植物RACK1蛋白氨基酸序列與動(dòng)物RACK1蛋白高度相似，并且含有動(dòng)物RACK1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域，因此可以推測(cè)植物RACK1蛋白可能具有動(dòng)物RACK1蛋白

2、的部分功能。植物RACK1基因最初是作為煙草BY-2懸浮細(xì)胞的一個(gè)生長(zhǎng)素誘導(dǎo)基因被發(fā)現(xiàn)的，后來的研究也證明RACK1蛋白參與植物多種與激素有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　水稻RACK1蛋白最早在1995年被報(bào)道。后來的研究發(fā)現(xiàn)水稻懸浮細(xì)胞中RACK1的表達(dá)可以被生長(zhǎng)素、脫落酸以及茉莉酸甲酯等激素誘導(dǎo);而水稻種子吸脹時(shí)ABA能引起RACK1蛋白的大量積累。由于赤霉素、脫落酸等激素對(duì)種子萌發(fā)的影響依賴于G蛋白信號(hào)途徑，因此推斷水稻中的RAC

3、K1蛋白可能通過調(diào)節(jié)G蛋白來控制激素信號(hào)響應(yīng);反之，G蛋白也可能通過調(diào)節(jié)RACK1來影響激素信號(hào)通路。
　　本研究以RACK1基因干擾、過表達(dá)及野生型植株為材料，通過對(duì)不同基因型水稻種子萌發(fā)階段施加不同濃度的外源ABA、H2O2等，觀察不同條件對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響，并通過相對(duì)定量PCR測(cè)定萌發(fā)進(jìn)程中RACK1基因的表達(dá)情況，種子萌發(fā)過程中一些酶的表達(dá)水平，及其在萌發(fā)不同時(shí)期的ABA及H2O2的含量，以期了解種子萌發(fā)中RACK1蛋白

4、與ABA或其他激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。為RACK1蛋白在水稻種子萌發(fā)中的功能及與G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系研究提供依據(jù)。
　　研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.種子萌發(fā)進(jìn)程試驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT，OX相比，RACK1A RNAi干擾植株的種子萌發(fā)延遲。外源ABA處理下，RNAi種子萌發(fā)率迅速下降，與WT，OX相比表現(xiàn)出對(duì)ABA超敏感。證明RACK1A參與調(diào)控種子萌發(fā)過程。
　　2.用不同濃度的ABA溶液處理水稻種子，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比

5、，處理后RACK1A蛋白表達(dá)水平下降。外源ABA處理種子后，RACK1表達(dá)下降，并導(dǎo)致H2O2含量下降，萌發(fā)延遲，加入外源H2O2可以恢復(fù)ABA引起的萌發(fā)延遲。說明ABA通過抑制RACK1，從而抑制萌發(fā)促進(jìn)劑H2O2抑制種子萌發(fā)。但是，外源H2O2不能消除不同基因型之間的萌發(fā)差異。
　　3.通過qPCR以及淀粉酶的酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，RNAi株系水稻中兩種淀粉酶的表達(dá)水平與酶活性皆低于WT，OX。說明ABA可能通過抑制RACK1蛋白的表

6、達(dá)阻礙種子萌發(fā)。
　　4.用基于序列分析的蛋白質(zhì)跨膜預(yù)測(cè)軟件對(duì)RACK1A進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)其為一種細(xì)胞質(zhì)蛋白。通過原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，將YFP-RACK1A轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體中，發(fā)現(xiàn)YFP-RACK1A熒光分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，表明RACK1A定位在細(xì)胞質(zhì)中。
　　5.對(duì)萌發(fā)24h、48h種子的ABA、H2O2含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，RNAi株系種子萌發(fā)24h、48h時(shí)ABA含量顯著高于WT，WT與OX

7、種子中ABA含量基本無(wú)差異。RNAi種子萌發(fā)24h、48h時(shí)，RNAi種子內(nèi)源H2O2顯著低于WT種子;OX種子中H2O2含量略大于WT。說明RACK1A可能通過某種方式抑制了ABA的合成，并促進(jìn)了過氧化氫的生成。
　　綜上所述，本研究證明水稻可影響種子中ABA的合成，通過維持或增加H2O2的量促進(jìn)種子萌發(fā)進(jìn)程，此外，RACK1還參與控制淀粉酶表達(dá)及活性影響種子萌發(fā)。而外源ABA可降低種子中RACK1的表達(dá)水平抑制種子萌發(fā)，說明A