細(xì)胞構(gòu)架蛋白RACK1調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 RACK1在胃癌組織中的表達(dá)和臨床意義
　　研究目的:胃癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的一類惡性腫瘤，目前仍是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)的第二大死因。胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移始終是影響胃癌療效進(jìn)一步改善的重要因素。蛋白激酶1活化受體(RACK1)是一個參與諸多細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的構(gòu)架蛋白，在多種腫瘤中的表達(dá)和意義已有報道。本研究旨在探討RACK1在胃癌中的表達(dá)和和臨床意義。
　　研究方法:收集在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的胃

2、癌患者癌和癌旁正常組織，及其臨床病理資料。其中，84例（2000年2月17日至2005年12月9日）用于構(gòu)建組織芯片，采用免疫組織化學(xué)法檢測RACK1蛋白的表達(dá)情況;15例（2011年3月21日至4月8日）采用免疫印跡法檢測RACK1蛋白的表達(dá)情況。將RACK1蛋白的表達(dá)情況與患者的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier法分析5年生存率，Cox回歸進(jìn)行多因素分析。
　　研究結(jié)果:免疫印跡法檢測表明，RACK1在胃

3、癌組織和癌旁正常組織中均有表達(dá)，而且癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織。免疫組織化學(xué)檢測表明，RACK1在胃癌組織中51例(60.7％)為低表達(dá)，33例(39.3％)為高表達(dá)。RACK1在胃癌組織中的低表達(dá)與Lauren's分型（彌漫型）、分化程度（低分化）、腫瘤浸潤深度（T3～T4）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N1～N3）和TNM分期（Ⅲ～Ⅳ）具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性（P＜0.05）。RACK1高表達(dá)組的5年生存率明顯優(yōu)于低表達(dá)組（P=0.022）;對于T2～

4、T4患者而言，RACK1高表達(dá)組的5年生存率同樣明顯優(yōu)于低表達(dá)組（P=0.014）。多因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移是胃癌患者術(shù)后生存的獨立影響因素，而RACK1的表達(dá)水平不是獨立影響因素。
　　研究結(jié)論:RACK1在胃癌組織中表達(dá)降低，并與不良預(yù)后因素和不佳的5年生存期相關(guān)，提示RACK1可能參與了對胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。
　　第二部分 RACK1通過抑制IL-8自分泌調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲
　　研究目的:腫瘤微環(huán)境對

5、于腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要影響。趨化因子白細(xì)胞介素8(IL-8)是腫瘤微環(huán)境中的一個重要調(diào)節(jié)因子，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-8，以自分泌或旁分泌方式促進(jìn)其增殖、血管新生，甚至侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討細(xì)胞構(gòu)架蛋白RACK1對胃癌細(xì)胞IL-8表達(dá)的調(diào)控和對侵襲性的影響。
　　研究方法:選取人胃癌HGC-27和MGC80-3細(xì)胞系，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)(shRNA)建立RACK1基因沉默細(xì)胞株，并收集不同細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。通過實時定量PCR和蛋

6、白印跡法檢測特定分子轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的變化。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測細(xì)胞上清IL-8的水平。通過細(xì)胞遷移實驗（細(xì)胞劃痕實驗）和細(xì)胞侵襲實驗（Transwell實驗）觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。通過細(xì)胞因子抗體芯片檢測細(xì)胞上清細(xì)胞因子的變化。通過抗體中和試驗檢測特定分子對細(xì)胞侵襲能力的影響。通過特異性抑制劑檢測特定信號通路對IL-8產(chǎn)生的影響。通過非參數(shù)Spearman'sρ檢驗分析胃癌組織中RACK1和IL-8表達(dá)的相關(guān)性。

7、　　研究結(jié)果:(1) RACK1基因沉默后，胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力均有顯著增強(qiáng)。來自RACK1基因沉默細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以顯著增強(qiáng)父代細(xì)胞的遷移和侵襲能力;(2)在細(xì)胞上清中，RACK1基因沉默細(xì)胞的IL-8表達(dá)顯著升高。IL-8中和抗體顯著抑制細(xì)胞的侵襲能力。提示胃癌細(xì)胞的RACK1下調(diào)后，通過上調(diào)IL-8增強(qiáng)侵襲能力;(3) NF-κB和c-Src特異性抑制劑（PDTC和PP2）可以顯著抑制IL-8的分泌。細(xì)胞過表達(dá)Src-顯性負(fù)

8、突變體或經(jīng)PP2處理后，IκBα的表達(dá)水平上調(diào)，核蛋白中NF-κB的P65亞基則顯著下調(diào)。提示Src/NF-κB信號通路可能參與RACK1對IL-8的表達(dá)調(diào)控;(4)IL-8受體CXCR1在MGC80-3細(xì)胞中高表達(dá)，CXCR2在HGC-27細(xì)胞中高表達(dá)。CXCR2中和抗體可抑制細(xì)胞的侵襲能力，提示IL-8/CXCR2軸可能參與調(diào)控胃癌的侵襲;(5)胃癌組織中RACK1和IL-8的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.514，P=0.000）;(6