OsRACK1在水稻種子萌發(fā)期響應(yīng)干旱和鹽脅迫的功能分析及其融合蛋白的表達(dá)和純化.pdf

1、干旱是人類所面臨的最嚴(yán)重的自然災(zāi)害之一，干旱導(dǎo)致水稻生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受阻，生育期顯著減慢，造成農(nóng)作物減產(chǎn)。因此，提高稻類對(duì)水分的利用率和對(duì)干旱的適應(yīng)性，已經(jīng)成為植物抗逆研究工作中急需解決的關(guān)鍵問題。已有研究表明擬南芥中rack1突變體具有很強(qiáng)的耐旱性，擬南芥AtRACK1參與了植物對(duì)滲透脅迫信號(hào)的響應(yīng)過程。以AtRACK1蛋白的氨基酸序列為模板對(duì)水稻基因組序列進(jìn)行比對(duì)，找到兩個(gè)與編碼AtRACK1蛋白高度同源的基因，在蛋白質(zhì)水平兩者與AtR

2、ACK1蛋白的同一性和相似性分別達(dá)到70％和80％，推測(cè)水稻的RACK1(OsRACK1)可能與擬南芥RACK1(AtRACK1)具有相似的功能。本文主要以水稻日本晴RACK1過量表達(dá)植株、表達(dá)受抑制植株和野生型植株為材料，研究水稻RACK1蛋白在種子萌發(fā)期響應(yīng)干旱和鹽脅迫中的功能，并初步探討了OsRACK1響應(yīng)干旱和鹽脅迫的作用機(jī)理。研究結(jié)果主要包括：
　　 1轉(zhuǎn)基因植株T2、T3代的鑒定。先通過GUS染色進(jìn)行初步的檢測(cè)，再通

3、過Southernblot對(duì)目的基因及目的基因的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，最后通過RQ-PCR對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行鑒定，篩選出所要的純合體轉(zhuǎn)基因植株。
　　 2 T3代種子萌發(fā)試驗(yàn)。對(duì)T3代種子進(jìn)行種子發(fā)芽試驗(yàn)，并檢測(cè)種子萌發(fā)過程中可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛(MDA)的含量及超氧化物岐化酶(SOD)活性。研究結(jié)果表明：過表達(dá)種子萌發(fā)比野生型種子快，反義抑制種子萌發(fā)低于野生型；過表達(dá)種子萌發(fā)時(shí)可溶性糖含量較高、SOD活性也較強(qiáng)；而可溶性

4、蛋白及MDA含量低。
　　 3將編碼水稻RACK1蛋白的基因克隆到質(zhì)粒pGEX-6P-1上，構(gòu)建全長(zhǎng)基因的原核表達(dá)載體pGEX-6P-1/OsRACK1，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)使水稻RACK1蛋白得以表達(dá)；優(yōu)化了表達(dá)條件：0.1mM IPTG、24℃為最佳表達(dá)條件。SDS-PAGE電泳分析其可溶性，結(jié)果表明約50％的融合蛋白可溶。選擇上清依次過谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂親和層析柱和Sepha