RACK1高表達(dá)對肝癌的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景:c-Jun N端蛋白激酶(JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族成員之一,其活化依賴于Ser183和Thr185的雙位點(diǎn)磷酸化(P-JNK)。與其他MAPK家族成員一樣,JNK的激活是由一系列蛋白激酶級聯(lián)活化介導(dǎo)的,即MAPK kinase kin-ase(MAP3K或 MEKK)、MAPK kinase(MAP2K或 MKK)和MAPK。MAP2Ks中的MKK7和MKK4特異性地磷酸化并活化JNK;MAP3Ks至少有17

2、個,分屬于幾種不同的結(jié)構(gòu)家族,其中MEKK1/2/3、MTK1(MEKK4)、TAK1等可活化MKK4和MKK7。JNK在肝癌中異?；罨?可以通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和對TRAIL、Fas誘導(dǎo)凋亡的抵抗來促進(jìn)肝癌發(fā)展。微環(huán)境中慢性炎癥可以引起肝癌細(xì)胞中JNK發(fā)生活化,但是,JNK活化發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)在因素還不得而知。激活的蛋白激酶C受體1(RACK1)與多種信號分子有相互作用,因此可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能,RACK1在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、

3、人黑色素瘤等多種腫瘤中高表達(dá)。
　　目的:檢測肝癌細(xì)胞中RACK1與P-JNK之間是否存在相關(guān)性;確定RACK1調(diào)控JNK通路的分子機(jī)制;檢測RACK1與MKK7之間的相互作用對肝癌細(xì)胞惡性生長的影響;檢測RACK1對肝癌細(xì)胞自噬的影響;探討RACK1高表達(dá)的機(jī)制。
　　方法:通過Western Blot檢測肝癌細(xì)胞系中P-JNK和RACK1蛋白的表達(dá),免疫共沉淀檢測在生理狀態(tài)下內(nèi)源RACK1與MKK7是否存在相互作用,通過

4、集落形成實(shí)驗(yàn)和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),探討了MKK7與RACK1相互作用的生物學(xué)效應(yīng);用體激酶活性分析實(shí)驗(yàn)探討RACK1增強(qiáng)MKK7磷酸化的機(jī)制;通過Western Blot和免疫熒光分析了RACK1對肝癌細(xì)胞自噬的影響;同時通過Western Blot探討了肝癌中RACK1高表達(dá)的機(jī)制。
　　結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中RACK1可以直接結(jié)合于JNK上游激酶MKK7蛋白,并且在肝癌組織和細(xì)胞中RACK1蛋白水平與JNK通路的活性高度相關(guān)。R

5、ACK1功能缺失與恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示RACK1高表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞中MKK7/JNK活性。進(jìn)一步研究顯示RACK1增強(qiáng)MKK7/JNK活性需要RACK與MKK7的相互作用, RACK1與MKK7相結(jié)合促進(jìn)了MAP3Ks磷酸化MKK7,從而在肝癌細(xì)胞中增強(qiáng) JNK活性,促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖以及對TRAIL、Fas誘導(dǎo)凋亡的抵抗,促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長。在肝癌細(xì)胞中敲低RACK1,自噬水平顯著升高。RACK1在肝癌細(xì)胞中的高表達(dá)與miR-99a和mi