基于在線微透析采樣與流動注射化學發(fā)光分析的抗體親和力測定新方法.pdf

1、隨著生物學和醫(yī)學的不斷發(fā)展，單克隆抗體技術在免疫治療、免疫分析、免疫純化等領域得到廣泛應用。在單克隆抗體的制備和篩選中，最重要的工作之一是對不同細胞株分泌的抗體的親和力這一關鍵指標進行評價。因此，研究快速、簡單、準確的抗體親和力測定新方法對于單克隆抗體的應用具有非常重要的指導意義。微透析（microdialysis，MD）是一種微量采樣技術，具有可原位、活體采樣和在線、實時檢測等特點。其工作原理是外部介質中的小分子物質在濃度梯度差的作用

2、下，被動擴散通過透析膜到達探針腔中，而蛋白質和細胞等大分子物質則被阻擋在外，從而實現對小分子物質的采樣。流動注射化學發(fā)光（flow injection-chemiluminescence，FI-CL）法是將微量、高速和自動化的進樣技術與高靈敏度的化學發(fā)光檢測技術結合而提出的一種痕量分析方法。其原理是待測物濃度與化學發(fā)光強度在一定范圍內呈線性定量關系，利用儀器對反應體系化學發(fā)光強度的測定，來確定待測物含量。本文將MD應用于小分子半抗原采樣

3、，結合高靈敏度的FI-CL分析，以β-激動劑這一不宜直接標記的小分子半抗原為例，在均相條件下研究這些小分子半抗原與抗體間的親和力，建立了MD-FI-CL的在線聯(lián)用方法，用于測定抗體親和力，為小分子半抗原的抗體性能評價提供了一個新型的分析方法平臺。
　　本研究主要內容包括：⑴利用在線MD采樣方法，結合高靈敏度的FI-CL分析法，在均相體系中研究特布他林與其單克隆抗體之間的親和力，提出了用于測定單克隆抗體親和力的免標記型新方法。MD探

4、針可以將結合型特布他林及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實現對小分子半抗原（特布他林）的取樣，隨后將含有游離型半抗原的透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，特布他林對魯米諾-鐵氰化鉀系統(tǒng)的化學發(fā)光有較強的增敏作用，因此，通過測定化學發(fā)光信號，可以實現透析液中特布他林的檢測。并通過MD探針的回收率校正，計算出免疫反應體系中游離半抗原的濃度，最后通過Scatchard和Klotz公式，計算得到特布他林單克隆抗體的親和力。兩種計算方法所得結果均

5、為4.9×106 M-1，說明特布他林單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結果與硫氰酸鹽洗脫法所得結果一致。該方法操作簡便、成本低、分析時間短，為單克隆抗體親和力的測定提供了新的途徑。⑵基于在線MD和FI-CL的聯(lián)用技術構建了一種測定抗體親和力的免標記型新方法，用于直接測定萊克多巴胺與其單克隆抗體間的親和力常數。MD探針可以將結合型萊克多巴胺及游離型抗體阻擋在半透膜外，從而實現對免疫反應體系中游離型萊克多巴胺的取樣，隨后將含有游離型半抗原的

6、透析液注入FI-CL系統(tǒng)。堿性條件下，萊克多巴胺對魯米諾-高錳酸鉀系統(tǒng)的化學發(fā)光有較強的增敏作用，因此，通過測定化學發(fā)光信號，可以實現對透析液中萊克多巴胺的檢測。并通過MD探針的回收率校正，計算出免疫反應體系中游離半抗原的濃度，最后通過Scatchard和Klotz分析，計算得到萊克多巴胺單克隆抗體的親和力。兩種分析方法所得結果均為1.0×106 M-1，說明萊克多巴胺單克隆抗體是中等親和力的抗體，該結果與硫氰酸鹽洗脫法所得結果一致。因