新型的無標記化學發(fā)光免疫分析新方法研究.pdf

1、無標記免疫分析技術(shù)能夠直接測定生物樣品，測定過程中無需預先對抗體或抗原進行標記，具有檢測成本低，樣品消耗少，耗費時間短，操作簡單等顯著優(yōu)勢，適應直接、實時、原位、在線的痕量免疫分析。而化學發(fā)光免疫分析，同時發(fā)揮了免疫分析的高特異性和化學發(fā)光檢測高靈敏的優(yōu)勢，逐漸發(fā)展成熟且在免疫分析領(lǐng)域已成為研究熱點之一。模擬酶制備簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境的影響，易修飾和改性，應用方便靈活，且具有較高的催化活性和專一的底物選擇性。此外，基于免疫傳感

2、陣列而建立起來的空間分辨多組分免疫分析方法可實現(xiàn)更高的檢測通量和多樣品的同時檢測。本論文首次提出了新型的無標記化學發(fā)光策略，并圍繞該分析策略，通過從天然酶到納米模擬酶以及從單組分免疫分析到多組分免疫分析的過渡，實現(xiàn)了快速、靈敏、低成本的檢測生物分子，具體開展了以下幾個方面的研究工作:
　　(1)本文首次提出了一種廉價、快速、簡便的無標記化學發(fā)光免疫分析新方法。該新型的分析策略通過將捕獲抗體和化學發(fā)光探針(辣根過氧化酶，HRP)共固

3、定于具有良好生物相容性的金納米粒子-殼聚糖(AuNPs-Chitosan)的固相復合界面，捕獲抗體與抗原的特異性結(jié)合將在傳感界面形成免疫復合物，該復合物會有效阻礙化學發(fā)光底物向HRP界面的擴散，并抑制酶催化的化學發(fā)光反應，從而引起化學發(fā)光信號的減弱。利用化學發(fā)光信號變化和目標抗原濃度的之間的線性關(guān)系，可實現(xiàn)快速的無標記化學發(fā)光檢測。相對傳統(tǒng)的標記化學發(fā)光免疫分析，該無標記免疫分析方法具有檢測成本低，樣品消耗少，耗費時間短，操作簡單等優(yōu)勢

4、。用人免疫球蛋白(HIgG)作為模型分析物，該分析體系的化學發(fā)光信號和HIgG濃度成良好的線性關(guān)系，其檢測的線性范圍為0.10-80ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)0.9980，檢測限為0.068ng/mL(信噪比為3)。此外，該無標記化學發(fā)光免疫傳感器具有高的靈敏度、強的特異性、可接受的重現(xiàn)性和實際樣品檢測的準確性。本文開創(chuàng)性地提出了無標記化學發(fā)光免疫分析新思想，將促進化學發(fā)光免疫分析技術(shù)的革新，對疾病診斷等領(lǐng)域的發(fā)展具有重要的意義。

5、　　(2)本文首次提出了一種基于硫化銅納米粒子過氧化氫模擬酶(CuSNPs)的無標記化學發(fā)光免疫分析方法。該CuSNPs模擬酶通過簡單的液相共沉淀方法合成得到，并展現(xiàn)了高效的催化活性和穩(wěn)定性。該分析策略通過將CuSNPs分散于殼聚糖溶液中，并滴涂于環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面形成信號層，然后將捕獲抗體通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)修飾在信號表面形成傳感層。在線溫育抗原后，傳感界面上的抗體特異性地捕獲抗原后形成免疫復合物。該復合物能有效阻礙化學發(fā)光

6、底物向信號界面的擴散并抑制模擬酶催化的化學發(fā)光反應，引起化學發(fā)光強度的減弱。相對于傳統(tǒng)的標記免疫分析，該分析方法具有簡單、廉價和分析速度快等優(yōu)點。用甲胎蛋白(AFP)作為模型分析物，該無標記化學發(fā)光免疫傳感器展現(xiàn)了寬的線性范圍(0.10-60ng/mL)，線性相關(guān)系數(shù)0.9980，檢測限為0.066ng/mL(信噪比為3)。此外，該基于硫化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)光免疫傳感器具有高的特異性和準確性、良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。本文成功發(fā)展了

7、一種新型的、可靠的、高效的無標記化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。
　　(3)本文合成了一種高性能氧化銅納米過氧化氫模擬酶，首次利用其構(gòu)建了新穎的無標記化學發(fā)光免疫分析方法。氧化銅納米模擬酶改善了傳統(tǒng)化學發(fā)光免疫分析中天然酶穩(wěn)定性差、易受環(huán)境影響等缺點，顯著提高了所構(gòu)建的化學發(fā)光體系的穩(wěn)定性和靈敏度，并且大大降低了檢測費用。該基于納米模擬酶的無標記化學發(fā)光分析策略通過將氧化銅納米棒分散于殼聚糖溶液并滴涂在環(huán)氧硅烷化的玻璃片表面;再將生物素化的

8、抗體修飾于鏈酶親和素功能化的氧化銅納米棒表面，封閉后即制得該無標記化學發(fā)光免疫傳感器;在線溫育抗原后，特異性反應后形成的免疫復合物能有效阻礙化學發(fā)光底物向氧化銅納米模擬酶的擴散并抑制模擬酶催化化學發(fā)光，引起化學發(fā)光強度的減弱。用癌胚抗原(CEA)作為模型分析物，該無標記化學發(fā)光免疫傳感器展現(xiàn)了寬的線性范圍為0.10-60ng/mL，線性相關(guān)系數(shù)0.9981，檢測限為0.048ng/mL(信噪比為3)。該基于氧化銅納米模擬酶的無標記化學發(fā)

9、光免疫分析方法，實現(xiàn)了蛋白快速、廉價、高靈敏檢測，在臨床診斷中極具前景。
　　(4)本文利用硫化銅納米模擬酶，發(fā)展了一種高靈敏的無標記化學發(fā)光成像多組分免疫分析新方法，用于兩種腫瘤標志物的同時檢測。通過絲網(wǎng)印技術(shù)在可拋式環(huán)氧硅烷化的載玻片表面制得4×12免疫傳感陣列，并將分散于殼聚糖的硫化銅納米粒子滴涂于陣列微孔中。然后將不同生物素化的抗體修飾于鏈酶親和素功能化的硫化銅納米粒子表面，封閉后即制得該無標記化學發(fā)光多組分抗體傳感陣列。

10、不同的捕獲抗體與其目標抗原發(fā)生特異性免疫反應，形成的免疫復合物能有效阻礙化學發(fā)光底物向硫化銅納米粒子的擴散并抑制模擬酶催化的化學發(fā)光反應，從而引起化學發(fā)光信號強度的減弱，由電荷耦合檢測器CCD收集該化學發(fā)光信號。以甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)作為模型分析物，該無標記免疫傳感陣列對AFP和CEA檢測的線性范圍分別是0.10-70和0.10-60ng/mL，檢測限分別是0.028和0.029ng/mL(信噪比為3)。該無標記免疫傳