丹酚酸B預防大鼠椎板切除術后硬膜外粘連的療效研究.pdf

1、腰椎手術失敗綜合征(FBSS)指一次或多次腰椎手術后，患者仍然出現(xiàn)復發(fā)性和/或持續(xù)性的下腰部疼痛，伴/不伴放射性神經痛，全球發(fā)生率高達10％～40％。
　　造成FBSS有多種因素，圍繞圍手術期的時間節(jié)點，可將因素概括為術前、術中、術后因素。術前因素主要包括:①患者的心理社會因素;②手術相關因素;③診斷遺漏因素。術中因素主要包括:①手術技巧欠佳;②術中手術節(jié)段定位錯誤;③過度減壓。術后因素主要包括:①椎間盤突出的復發(fā);②椎間隙感染;

2、③硬膜外粘連（epidural adhesion，EA）。椎板切除術為硬膜外腔隙的手術操作，術后愈合過程中硬膜外瘢痕組織的產生是難以避免的，過度增生的硬膜外瘢痕組織隨著不斷成熟形成硬膜外纖維化（epidural fibrosis，EF），可對神經根形成擠壓、栓系，同時干擾腦脊液流動，最終導致術后癥狀的發(fā)生、加重。
　　EA目前已成為引起FBSS的重要原因之一。目前，在EA治療方面，廣大學者已達成共識，最佳的治療方法即為預防EA形成

3、。國內外廣大學者在預防EA形成方面做了大量的臨床與基礎研究工作，近期研究表明，已有學者通過動物模型對EA預防做了廣泛嘗試，包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、鈣通道阻滯劑、干細胞移植、自體脂肪移植、骨水泥移植、藥物凝膠應用、蜂蜜等，這些研究均被證實可在一定程度上達到預防EA形成的目的。但迄今為止，尚沒有一種方法可在臨床得以廣泛推廣。
　　丹酚酸B(salvianolic acid,Sal B)是丹參的根莖提取物，為丹參主要的水溶性成分之

4、一，也是臨床上注射用丹參多酚酸鹽的主要構成成分。近年來已有Sal B在抗纖維化、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑制細胞凋亡、清除自由基等方面的應用和研究報道。已有學者通過Sai B在肝纖維化抑制方面、減緩肺纖維化進展方面、防治糖尿病腎病方面、腫瘤殺傷方面、抑制缺血再灌注后腦血管炎癥方面、治療神經退行性疾病方面等展開了一些研究，并取得了一定成績。
　　基于上述研究背景，本課題擬采用椎板切除的動物模型，探究Sal B在預防硬膜外粘連方面的安全

5、性、可行性與療效性，并初步探索其作用機制。整體研究分為兩個部分:
　　第一部分 丹酚酸B預防大鼠椎板切除術后硬膜外粘連的可行性研究。
　　在本部分研究中，60只Wistar大鼠隨機分為Sal B治療組、Vehicle對照組、單純手術對照組，每組20只。將丹酚酸B溶于生理鹽水中制備成濃度為7.5mg/ml的Sal B鹽水溶液。以電子秤稱重動物，以水合氯醛行腹腔注射進行麻醉，注射量根據動物體重(0.3ml/100g)。麻醉滿意后

6、對大鼠進行編號標記，根據經典的動物腰椎板切除術進行標準化造模:選擇L1、L2節(jié)段備皮處理，以碘伏反復擴大消毒3遍。大鼠鋪巾后取俯臥位，手術入路取背側的正中手術切口，長度約為4～5cm，以尖刀逐層切開皮膚，并剪開深筋膜，鈍性分離L1～L2椎體椎旁肌，充分暴露L1～L2棘突，以咬骨鉗整體將棘突咬除，以蠶食法咬除椎板，顯露L1節(jié)段的硬脊膜，所開的骨窗約為4mm×5mm。以生理鹽水沖洗傷口后行止血，無明顯出血點后關閉手術傷口。造模后觀察大鼠麻醉

7、復蘇情況，待度過危險期后即行藥液灌胃治療:Sal B治療組采用丹酚酸B藥物溶液灌胃治療，劑量為30mg/kg/d，Vehicle組給予等體積的生理鹽水進行灌胃治療，單純手術對照組不予治療干預。術后大鼠保持分籠飼喂，每籠不超過3只，室溫需維持在20～28℃之間。術后需進行連續(xù)3天的肌肉注射抗生素，同時密切觀察大鼠傷口情況，防止感染。
　　造模4周后，以隨機原則從每組中抽選動物。從每組動物中抽選出5只進行Rydell評分宏觀評估;從每

8、組動物中抽選出5只，行過量麻醉處死，沿原手術切口進入，暴露術野，小心剪取硬膜外瘢痕組織，烘干組織標本，并將組織標本冷凍貯存，行硬膜外瘢痕組織羥脯氨酸含量測定;從每組動物抽選出5只，行過量麻醉致死后，沿原手術切口進入，準確定位并完整暴露L1節(jié)段椎體，以生理鹽水及PFA溶液灌注固定后，將L1椎體整體取下浸入至脫鈣試劑液中，待脫鈣滿意后行石蠟包埋并行組織塊切片，切片后行馬松三染色、蘇木精伊紅染色、VEGF免疫組織化學染色;從每組動物中抽選出5

9、只，行過量麻醉處死，沿原手術切口進入，取硬膜外瘢痕粘連組織，行烤箱標本烘干，行Real-time PCR檢測硬膜外瘢痕組織中炎性因子表達情況。采用SPSS軟件包對所得結果進行統(tǒng)計學分析，所得量化數據以(-X)±s表示，采用單因素方差分析，采用q檢驗進行組間數據的比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　造模后4周，各檢測結果可見:
　　Rydell評分可見:Vehicle對照組和單純手術對照組的硬膜外瘢痕粘連程度較Sal

10、 B治療組重，可見嚴重的纖維組織增生，硬脊膜與術野瘢痕粘連嚴重，同時可見劇烈的炎癥反應。Sal B治療組的粘連情況較Vehicle對照組和單純手術對照組明顯減輕，局部可見松散狀瘢痕組織，硬脊膜偶可見薄膜樣粘連，粘連不緊密，可順利將硬膜進行分離。
　　羥脯氨酸檢測結果提示:Vehicle對照組羥脯氨酸含量為（50.34±4.19）mg，單純手術對照組羥脯氨酸含量為（53.59±3.27）mg，Sal B治療組羥脯氨酸含量為（31.5

11、4±5.06）mg。同單純手術對照組相比，Vehicle對照組羥脯氨酸含量無顯著差異(P＞0.05)，Sal B治療組羥脯氨酸含量顯著降低(P＜0.05)。
　　馬松三染色結果可見:L1椎體的石蠟切片馬松三染色結果提示:膠原纖維呈藍色，骨組織、肌纖維呈紅色，胞核呈藍褐色。Vehicle對照組和單純手術對照組可見致密膠原沉積，硬膜外瘢痕組織與硬膜粘連緊密;SalB治療組可見膠原纖維散在存在，硬膜與硬膜外瘢痕組織無明顯粘連。
　

12、　各組樣品的切片經VEGF免疫組化染色后行光密度半定量結果提示:Sal B治療組VEGF半定量結果為12.31±6.42、Vehicle對照組VEGF半定量結果為50.27±4.39、單純手術對照組VEGF半定量結果為52.04±3.28，其中Vehicle對照組相較單純手術對照組，VEGF表達無顯著性差異(P＞0.05)，Sal B治療組相較單純手術對照組及Vehicle對照組，VEGF表達顯著降低(P＜0.05)。
　　第二部

13、分 丹酚酸B預防大鼠椎板切除術后硬膜外粘連的劑量研究。
　　在本部分研究中，40只Wistar大鼠隨機分為Sal B(10mg/kg)組、Sal B(30mg/kg)組、Sal B(50mg/kg)組、對照組（生理鹽水組），每組10只。將丹酚酸B溶于生理鹽水中分別制各成濃度為2.5mg/ml、7.5mg/ml及12.5mg/ml的Sal B鹽水溶液，充分震蕩使其溶解。動物造模同上，給藥治療方式同上。造模8周后，每組動物均行Ryde

14、ll評分宏觀評估;從每組動物中以隨機原則抽選出5只，行過量麻醉致死后，沿原手術切口進入，準確定位并完整暴露L1節(jié)段椎體，以生理鹽水及10％PFA溶液灌注固定后，將L1椎體整體取下浸入至脫鈣試劑液中，待脫鈣滿意后行組織學染色觀察;造模8周后，從每組動物中以隨機原則抽選出5只，行過量麻醉致死后，沿原手術切口進入，以尖刀/剪刀剪取收集硬膜外瘢痕組織，行VEGF的Western Blot檢測;采用SPSS16.0軟件包(SPSS Incorpo

15、ration，Chicago，IL，US)進行統(tǒng)計學分析，所得量化數據采用重復量測變異數分析，采用q檢驗進行組間數據的比較，以P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。
　　造模后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，各組大鼠在術后均出現(xiàn)一定程度的食欲不佳、少飲少排及體重下降，術后5～7天各組大鼠逐漸恢復正常。術后第4天有三只大鼠有血尿跡象，疑為手術創(chuàng)傷所致，未行特殊處理兩天后好轉。各組大鼠均順利存活至樣品收集，無死亡。
　　造模8周后，各檢測指標結

16、果如下:
　　大鼠硬膜外瘢痕粘連情況Rydell評分可見:對照組和Sal B(10mg/kg)組的硬膜外瘢痕粘連程度較重，可見嚴重的纖維組織增生，硬脊膜與術野瘢痕粘連嚴重，同時可見劇烈的炎癥反應。Sal B(30mg/kg)組和Sal B(50mg/kg)組的粘連情況較輕，局部可見松散狀瘢痕組織，硬脊膜偶可見薄膜樣粘連，粘連不緊密，可順利將硬膜進行分離。
　　L1椎體的石蠟切片HE染色結果提示:骨組織、肌纖維呈紅色，胞核呈藍

17、褐色。Sal B10mg/kg組和對照組可見硬膜外腔隙被瘢痕組織填充，并可見瘢痕組織擠壓硬膜并形成致密粘連;Sal B30mg/kg組與Sal B50mg/kg組可見硬膜外腔隙中散在松散的瘢痕組織，瘢痕組織與硬膜未形成明顯粘連。
　　本研究得出以下結論:
　　(1)丹酚酸B在預防大鼠椎板切除術后硬膜外粘連形成方面具有顯著效果;
　　(2)丹酚酸B在預防大鼠椎板切除術后硬膜外粘連方面呈現(xiàn)劑量效應，本研究結果提示相較10m