三七凝膠對家兔椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕中膠原代謝和瘢痕攣縮的影響.pdf

1、研究背景
　　 脊柱椎板減壓術(shù)后硬膜外瘢痕是導(dǎo)致繼發(fā)性椎管狹窄的重要因?yàn)橹?因此,預(yù)防硬膜外瘢痕粘連,防止繼發(fā)性椎管狹窄,對手術(shù)預(yù)后癥狀的改善,功能的恢復(fù)具有重要意義。中藥通過活血化瘀、益氣止血減少瘢痕形成的研究多有報(bào)道,我們前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)三七凝膠能夠有效預(yù)防椎板減壓術(shù)后硬膜外瘢痕粘連的形成。中藥三七具有止血活血及抗纖維化作用,透明質(zhì)酸鈉為生物體內(nèi)普遍存在的酸性粘多糖,具有良好的生物相容性,并具有一定的預(yù)防術(shù)后瘢痕粘連的

2、作用。本研究采用中藥三七配合載體透明質(zhì)酸鈉作為凝膠基質(zhì),制成三七透明質(zhì)酸鈉凝膠(以下簡稱三七凝膠),作為新的手術(shù)中植入材料,在膠原代謝和瘢痕攣縮等方面進(jìn)行預(yù)防瘢痕粘連的機(jī)理探索。
　　 研究目的
　　 1觀察三七凝膠對家兔硬膜外瘢痕組織的病理形態(tài)學(xué)改變及Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的生長情況的影響。
　　 2研究三七凝膠對家兔硬膜外瘢痕組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、TIMP-1、MMP-1、α—SMA等相關(guān)細(xì)胞因子和膠原酶表達(dá)

3、的影響,探討三七凝膠在膠原代謝和瘢痕攣縮方面對硬膜外瘢痕的作用。
　　 研究方法
　　 1三七凝膠的配制
　　 取三七生藥加60％乙醇回流提取,醇提液回收乙醇,濃縮,加水返溶,取上清液,加入透明質(zhì)酸鈉,靜置使完全溶脹,攪拌均勻,加注射用水調(diào)整體積,滅菌30分鐘,即得(每毫升凝膠含三七生藥0.5g)。
　　 2實(shí)驗(yàn)方法
　　 大耳白品系家兔96只,體重2.0～2.5kg,6月齡,雌雄各半,按照完全隨

4、機(jī)方法分為生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組、三七凝膠組,制作家兔椎板切除模型,分別在硬膜囊周圍滴注生理鹽水、三七濃縮液、透明質(zhì)酸鈉、三七凝膠各0.5ml,各組術(shù)后1、2、4、8周取材,HE染色觀察硬膜外瘢痕組織中的病理形態(tài)改變,苦味酸-天狼星紅染色觀察Ⅰ型、Ⅲ型膠原生長分布情況,原位雜交方法分析Ⅰ型膠原mRNA、Ⅲ型膠原mRNA、TIMP-1mRNA、MMP-1mRNA的表達(dá),免疫組織化學(xué)方法分析α—SMA抗體的表達(dá)。
　　 結(jié)

5、果：
　　 1病理形態(tài)觀察
　　 1.1 HE染色
　　 ①一周:硬膜外見未完全吸收的血腫被炎性細(xì)胞包繞,胞外有少量的新生膠原纖維。生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組可見肉芽組織與硬膜囊結(jié)合較緊密,三七凝膠組硬膜外可見有潛在的腔隙,硬膜外血腫及炎性細(xì)胞較其它三組明顯減少(圖1-1～1-4)。
　　 ②二周:硬膜外血腫已吸收完全,被肉芽組織填充,胞外新生膠原纖維增多,三七凝膠組硬膜外粘連不明顯,生理鹽水組廣泛

6、粘連,較三七組、透明質(zhì)酸鈉組更加明顯(圖1-5～1-8)。
　　 ③四周:肉芽組織纖維化明顯,膠原纖維趨于成熟,三七凝膠組瘢痕與硬膜囊無明顯粘連,其間有空隙存在,生理鹽水組粘連進(jìn)一步加重,三七組、透明質(zhì)酸鈉組較生理鹽水組粘連有所減輕(圖1-9～1-12)。
　　 ④八周:瘢痕組織出現(xiàn)攣縮,部分組織骨化閉合椎板缺損處,三七凝膠組硬膜外間隙明顯,生理鹽水組粘連致密,三七組、透明質(zhì)酸鈉組粘連程度介于前兩者之間(圖1-13～1-

7、16)。
　　 1-2苦味酸-天狼星紅染色
　　 苦味酸-天狼星紅染色切片在普通顯微鏡下膠原纖維呈粉紅色,在偏振光顯微鏡下,Ⅰ型膠原呈粗大的紅色或黃色纖維,Ⅲ型膠原呈細(xì)的網(wǎng)狀或點(diǎn)狀綠色纖維,多分布于Ⅰ型膠原周圍。
　　 ①一周:造模區(qū)的膠原纖維較少,可見疏松的條束狀Ⅰ型膠原,Ⅲ型膠原呈點(diǎn)狀細(xì)纖維,散布于Ⅰ型膠原周圍。各組膠原纖維較稀少,排列無明顯規(guī)律性(圖2-1～2—4)。
　　 ②二周:造模區(qū)的膠原纖維

8、較一周時(shí)明顯增多,可見較為致密的條束狀Ⅰ型膠原,點(diǎn)狀Ⅲ型膠原散布于Ⅰ型膠原周圍。生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組中Ⅰ型膠原明顯增多,縱橫交錯(cuò),排列較為紊亂,Ⅲ型膠原相對較少。三七凝膠組中Ⅰ型膠原順序排列,Ⅲ型膠原排布較其它三組密集(圖2—5～2—8)。
　　 ③四周:造模區(qū)膠原纖維較二周時(shí)明顯增多增粗,分布更加密集,Ⅰ型膠原明顯增粗,Ⅲ型膠原呈網(wǎng)狀散布于Ⅰ型膠原周圍。生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組中Ⅰ型膠原縱橫交錯(cuò),排列紊亂,

9、三七凝膠組中Ⅰ型膠原順序排列,趨于規(guī)則,較其它三組稀疏,Ⅲ型膠原排布較其它三組密集(圖2-9～2—12)。
　　 ④八周:造模區(qū)膠原纖維較四周時(shí)有所減少,Ⅰ型膠原呈束帶狀分布,Ⅲ型膠原呈網(wǎng)狀分布于Ⅰ型膠原四周。生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組中Ⅰ型膠原縱橫交錯(cuò),排列紊亂,三七凝膠組中Ⅰ型膠原順序排列,規(guī)則,較其它三組稀疏,Ⅲ型膠原排布較其它三組密集(圖2-13～2—16)。
　　 2膠原纖維面密度
　　 Ⅰ型膠原

10、面密度三七凝膠組在用藥4周、8周時(shí)明顯低于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01)。三七組、透明質(zhì)酸鈉組在用藥1周、2周、4周時(shí)明顯低于生理鹽水組(P<0.01或P<0.05)；Ⅲ型膠原面密度三七凝膠組在用藥4周、8周時(shí)明顯高于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01)。三七組、透明質(zhì)酸鈉組在用藥1周、2周、4周時(shí)明顯高于生理鹽水組(P<0.01或P<0.05)。(表1；表2)
　　 3相關(guān)細(xì)胞因子、膠原酶的表達(dá)<

11、br>　　 3.1Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)
　　 Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)三七凝膠組在用藥4周時(shí)明顯低于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01),三七組、透明質(zhì)酸鈉組在用藥1周、2周時(shí)明顯低于生理鹽水組(P<0.01或P<0.05)；Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)三七凝膠組在用藥4周時(shí)明顯高于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01)。(表3；表4)
　　 3.2 TIMP-1 mRNA、MMP—1 mRNA的表達(dá)<

12、br>　　 TIMP-1 mRNA表達(dá)用藥2、4周時(shí)三七凝膠組明顯低于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01或P<0.05),三七組、透明質(zhì)酸鈉組明顯低于生理鹽水組(P<0.01或P<0.05)；MMP-1 mRNA表達(dá)三七凝膠組在用藥2、4周時(shí)明顯高于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01或P<0.05),三七組、透明質(zhì)酸鈉組在用藥2周時(shí)明顯高于生理鹽水組(P<0.05)。(表5；表6)
　　 3.3α—SM

13、A抗體的表達(dá)
　　 α—SMA抗體表達(dá)在用藥1周、2周時(shí),三七凝膠組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組明顯低于生理鹽水組(P<0.01或P<0.05),三七凝膠組與三七組、透明質(zhì)酸鈉組差異不顯著(P>0.05)；用藥4周、8周時(shí),三七凝膠組明顯低于生理鹽水組、三七組、透明質(zhì)酸鈉組(P<0.01或P<0.05),三七組、透明質(zhì)酸鈉組與生理鹽水組差異不顯著(P>0.05)。(表7)
　　 結(jié)論：
　　 1三七凝膠能夠減輕硬膜外瘢