β-淀粉酶-海藻糖合酶雙功能融合酶基因工程菌的構(gòu)建及高效表達(dá).pdf

1、海藻糖作為一種不具有還原性的雙糖，有很好的保水性，能夠在干燥條件下維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性。它還可以在高溫條件下穩(wěn)定酶蛋白、食品、化妝品和藥物，維持細(xì)胞的生存，保護(hù)蛋白質(zhì)在干燥和冷凍時(shí)不發(fā)生變性，由于特殊的性質(zhì)，使它的商品化前景很可觀。
　　由于得到海藻糖的方法復(fù)雜，成本一直居高不下，嚴(yán)重影響了它的應(yīng)用。為了能夠得到更為簡單、低成本生產(chǎn)海藻糖的工程菌以及方法，本研究以 Bacillus cereus的β-淀粉酶和Pseudomonas

2、putida06的海藻糖合酶為出發(fā)點(diǎn)，利用分子生物學(xué)方法對兩種基因進(jìn)行拼接，得到了同時(shí)具有β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因的融合酶蛋白基因，并在E.coli BL21中得到了雙功能融合蛋白。
　　本研究首先通過PCR技術(shù)，分別以Bacillus cereus基因組DNA和Pseudomonas putida06基因組DNA為模板進(jìn)行克隆，得到了β-淀粉酶基因和海藻糖合酶基因，并成功構(gòu)建了β-淀粉酶和海藻糖合酶重組質(zhì)粒pET-28a-

3、ba和pET-28a-ts，在E.coli BL21得到了重組酶蛋白。重組β-淀粉酶在pH6.47、45℃條件下，催化2％的直鏈淀粉12h后得到15.71g/L的麥芽糖，酶活力為12.11U/ml，麥芽糖產(chǎn)率78.5%。重組海藻糖合酶在pH7.4、45℃下，催化15%的麥芽糖溶液12h得到57.38g/L的海藻糖，酶活力為42.13U/ml，海藻糖產(chǎn)率38.9%。
　　本研究采用了β-淀粉酶-海藻糖合酶和海藻糖合酶-β-淀粉酶兩種

4、連接順序，以及LGSRSAEL、(GGGGS)2和(EAAAK)3作為連接肽，通過酶連法構(gòu)建了6種融合酶，并且均在E.coli BL21中得到表達(dá)。重組融合蛋白大小約為120kDa，在LB培養(yǎng)基條件下進(jìn)行，盡管SDS-PAGE顯示6種融合蛋白都有表達(dá)，但重組融合酶中只有BAP3TS、TSP2BA和TSP3BA三種融合蛋白表現(xiàn)出了β-淀粉酶和海藻糖合酶雙功能特性。
　　本研究通過比較 LB培養(yǎng)基與M9-ZJ培養(yǎng)基對融合酶重組菌的影響

5、，認(rèn)為M9-ZJ培養(yǎng)基更利于重組融合蛋白的表達(dá)。在M9-ZJ培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對成分進(jìn)行了初步的單因素選擇，經(jīng)優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)的6種融合酶重組菌所表達(dá)的融合酶蛋白均具有β-淀粉酶與海藻糖合酶雙功能特性。其中融合酶BAP3TS對淀粉的催化效率最高，在pH7.0、45℃下催化6%的淀粉溶液最高可得到25.36g/L的海藻糖，酶活力為37.24U/ml，海藻糖產(chǎn)率42.27%。與LB培養(yǎng)基條件下得到的結(jié)果相比，海藻糖產(chǎn)量提高了大約11倍，與混合