高效木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶酶學(xué)性質(zhì)與功效研究.pdf

1、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文高效木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及重組酶酶學(xué)性質(zhì)與功效研究姓名：何軍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)指導(dǎo)教師：陳代文20080601四川農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文℃，最適反應(yīng)p H 為6 ．0 ；該酶在5 0 。C 下相當(dāng)穩(wěn)定，在此溫度下保溫3 0 m i n 后，其相對(duì)酶活可維持在9 0 ％以上；而在6 0 。C 下保溫3 0 m i n 后，P T X 2 相對(duì)酶活僅維持在3 0 ％左右；P T X 2 對(duì)燕

2、麥木聚糖的親和力強(qiáng)于樺木木聚糖，其‰值分別0 ．9m g ／m L 和1 ．2m g ／m L ；與親本酶一樣，P T X 2 不能與纖維素有效結(jié)合，但能與木聚糖結(jié)合；P T X 2為內(nèi)切型木聚糖酶，當(dāng)以燕麥木聚糖為底物時(shí)，其水解產(chǎn)物主要為木二糖及木二糖以上的木寡糖，另有少量木糖。4 ． 耐熱木聚糖酶基因X y n 2 - A 2 的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的表達(dá)通過(guò)基因全序列合成，將海棲熱袍菌X y n A 的耐熱結(jié)構(gòu)域A 2 融合至X

3、y n 2 基因N ．末端，成功構(gòu)建了耐熱木聚糖酶基因及其畢赤酵母表達(dá)載體p P I C Z a A ．X y n 2 ．A 2 ，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后獲得了能夠分泌表達(dá)耐熱木聚糖酶的基因工程菌P X C ．1 ；其重組酶P T X C 2 分子量大小為2 7 k D a ，在普通搖瓶中進(jìn)行誘導(dǎo)獲得了約9 0 U ／m L 的表達(dá)水平；P T X C 2 最適反應(yīng)溫度為6 5 。C ，最適反應(yīng)p H 為6 ．0 ；該酶耐熱性較P T X 2

4、有明顯改善，在6 0 ℃下保溫3 0 m i n 后，P T X C 2 殘余酶活高達(dá)7 4 ％；與P T X 2 和親本酶相似，P T X C 2對(duì)纖維素幾乎沒(méi)有結(jié)合能力，但P T X C 2 對(duì)木聚糖的結(jié)合力強(qiáng)于P T X 2 。5 ． 重組木聚糖酶小規(guī)模發(fā)酵制備及其應(yīng)用效果評(píng)定利用1 5L 自動(dòng)發(fā)酵系統(tǒng)對(duì)畢赤酵母基因工程菌P X ．1 進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)，重組酶P T X 2 產(chǎn)量提高了近一倍，最高達(dá)到了5 6 0U ／m L ，

5、且純度較高：在仔豬飼糧中添加液體重組酶P T X 2 ( 5 0 0 U ／k g ) ，仔豬平均日增重提高了1 6 ．9 ％；飼糧粗蛋白、灰分、鈣和粗纖維的表觀消化率分別提高了1 ．7 ％、3 ．4 ％、2 ．5 ％和2 ．6 ％，該結(jié)果表明，重組酶P T X 2 能夠部分消除飼糧中木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能。綜上所述，本研究構(gòu)建了木聚糖酶E c o l i 基因工程菌，其重組酶活性較強(qiáng)，但表達(dá)水平偏低；利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)