11418.脫氧核糖醛縮酶的基因工程菌構(gòu)建與表達及初步應(yīng)用研究

1、分類號：密級：UDC：學(xué)號：405813011040南昌大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文脫氧核糖醛縮酶的基因工程菌構(gòu)建與表達及初步應(yīng)用研究Construction、expressionofdeoxyriboaldolasesgeneengineeringbacteriapreliminaryapplicationresearchofdeoxyriboaldolases劉松培養(yǎng)單位(院、系)：環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院指導(dǎo)教師姓名、職稱：余勃副教授申請學(xué)位

2、的學(xué)科門類：工學(xué)學(xué)科專業(yè)名稱：生物化工論文答辯日期：答辯委員會主席：評閱人：2014年5月摘要II摘要脫氧核糖醛縮酶(DARE)是一種醇醛縮合裂解酶，普遍存在于動植物及微生物體內(nèi)。DERA在碳碳加成反應(yīng)中，起著重要作用。特別是它能夠以三分子乙醛或者其他醛酮結(jié)構(gòu)為底物，經(jīng)過兩步羥醛縮合反應(yīng)得到他汀類藥物手性側(cè)鏈。他汀類藥物能夠降低體內(nèi)膽固醇含量，在降血脂藥物中占有重要地位。DERA作為一個生物催化劑，能夠避免化學(xué)方法合成他汀類藥物中所碰到

3、的手性選擇問題，因而，在手性合成反應(yīng)中具有潛在的應(yīng)用價值。本文主要通過構(gòu)建一株原核工程菌和一株真核工程菌來表達DERA，并且研究比較了它們各自所得到的DERA的特性及初步應(yīng)用研究。主要研究成果如下：1.DERA真核工程菌的構(gòu)建及表達：采用PCR反應(yīng)從E.coliBL21(DE3)plysS中擴增得到DERA基因片段，將DERA基因片段與質(zhì)粒載體pPIC9K連接構(gòu)建得到重組載體pPIC9KDERA，用SalI酶對其酶切后再電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵

4、母GS115感受態(tài)細胞，經(jīng)G418抗性獲得多拷貝產(chǎn)DERA的重組畢赤酵母工程菌(GS115pPIC9K–DERA)；用1%甲醇在不同時機對重組GS115菌株進行誘導(dǎo)表達DERA，經(jīng)SDSPAGE電泳測定，分子量為28.6kDa，該酶在文中表示為：GSDERA。2.DERA原核工程菌的構(gòu)建及表達：采用PCR反應(yīng)從BL21擴增得到DERA基因片段，將該基因片段與pETDsbA載體連接得到的重組載體pETDsbADERA；將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿

5、主菌BL21，構(gòu)建得到產(chǎn)DERA的工程菌BL21(pETDsbADERA)；采用IPTG對BL21(pETDsbADERA)菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集細胞，超聲波破碎細胞后，SDSPAGE電泳檢測顯示，實現(xiàn)了DERA與DsbA的融合表達，得到50kDa左右大小的融合蛋白(DERA：28.6kDa，DsbA：21kDa)，該融合蛋白在文中表示為：BLDERA。3.DERA的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究：1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)GS115pPIC9K–DER