微晶體法固定化辣根過氧化物酶及其結構與功能關系的研究.pdf

1、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP，E.C.1.11.1.7)是一種來源最為廣泛而價格較為低廉的植物過氧化物酶，可以在過氧化氫或有機過氧化物作用下催化芳香族化合物的氧化。其在有機合成、聚合物合成和含酚廢水的治理上有極其廣泛的應用。但因酶對熱、酸、堿、氧化劑、有機溶劑和重金屬離子的穩(wěn)定性差，同時酶在有機相中反應的效率比在水相中低幾個數(shù)量級等缺陷，限制了其商業(yè)化的應用。為了改善辣根過氧化物酶的催化性能，在查

2、閱并分析大量文獻的基礎上，確立了以辣根過氧化物酶為研究對象，以提高其催化性能為研究目標，選用微晶體法對辣根過氧化物酶進行了固定化的研究，并從動力學、熱力學、蛋白質(zhì)固體構象等多個方面研究和分析了其催化性能得以改善的機制，取得了較為滿意的結果。論文的主要內(nèi)容如下： 1.通過對形成微晶體酶的三個影響因素(載體、賦形劑以及含水的沉淀有機溶劑)進行篩選，從而獲得提高辣根過氧化物酶催化性能的最佳固定化條件。選取了提高催化性能的效果最好的氯化

3、鉀(KCl)飽和溶液作為載體、2-奈酚(2-Naphthol)作為賦形劑、乙腈(1﹪H<,2>O<,2>v/v)、丙醇(1﹪H<,2>O<,2>v/v)、丙酮(1﹪H<,2>O<,2>v/v)等作為沉淀有機溶劑對辣根過氧化物酶進行微晶體法(protein-coatedmicro-crystals PCMCs)固定化，得到的三種微晶體酶(KNA-PCMC-HRP、KNP-PCMC-HRP和KNT-PCMC-HRP)，并對它們的性質(zhì)進行進一

4、步的研究。 2.采用微晶體法固定化辣根過氧化物酶得到的三種微晶體酶(KNA-PCMC-HRP、KNP-PCMC-HRP和KNT-PCMC-HRP)與天然辣根過氧化物酶相比，它們的相對酶活分別提高了27﹪、15﹪、28﹪。微晶體酶的熱穩(wěn)定性都得到3倍左右的提高，動力學數(shù)據(jù)表明微晶體酶對底物的親和性和催化效率都比天然酶高，熱力學數(shù)據(jù)也證明了其熱穩(wěn)定性得到了提高。表征蛋白質(zhì)構像的光譜結果表明，KNT-PCMC-HRP的催化性能得以改善

5、的機制主要是由于這種微晶體固定化方法改變了天然酶分子的結構，即微晶體酶中卟啉和色氨酸周圍的環(huán)境發(fā)生了改變，二級結構成分中β-折疊和轉角成分增加，使得蛋白質(zhì)結構更加穩(wěn)定。 3.在有機溶劑中的催化研究發(fā)現(xiàn)，微晶體酶與天然酶相比，其穩(wěn)定性、催化活性和比活都得到了提高，而且在低濃度有機溶劑中失活程度較小。在高溫下(60℃)，明顯發(fā)現(xiàn)KNT-PCMC-HRP微晶體酶的耐有機溶劑的能力得到較好的改善，尤其當甲醇和乙醇的含量低于40﹪時，酶的