鑭（Ⅲ）、鋱（Ⅲ）對(duì)體內(nèi)外辣根過(guò)氧化物酶活性與結(jié)構(gòu)的影響研究.pdf

1、近年來(lái)，稀土元素在各個(gè)領(lǐng)域廣為應(yīng)用。特別是在中國(guó)和其他一些國(guó)家，稀土微肥被成功用于促進(jìn)作物生長(zhǎng)和提高產(chǎn)品品質(zhì)，已有30余年的歷史。據(jù)報(bào)道，適量稀土對(duì)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)品品質(zhì)及抗逆性方面有促進(jìn)作用，但是當(dāng)稀土濃度過(guò)高時(shí)，則起抑制作用，表現(xiàn)為“低促高抑(hormesiseffect)”現(xiàn)象。植物體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)，如過(guò)氧化氫酶，過(guò)氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶對(duì)稀土敏感。因此，保護(hù)酶如過(guò)氧化物酶可作為生物標(biāo)記物來(lái)研究酶與稀土的相互作用。然而，由

2、于植物細(xì)胞壁的阻隔作用，稀土能否進(jìn)入細(xì)胞及其對(duì)POD在植物細(xì)胞的分布、活性和結(jié)構(gòu)的影響機(jī)理，以及POD生物活性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系至今仍不清楚。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為POD酶超家族的一員，其主要源自辣根，且HRP分離純化及其結(jié)構(gòu)研究透徹。本論文中，HRP作為過(guò)氧化物酶的典型模型，通過(guò)多學(xué)科交叉合作，研究了輕稀土離子La3+和重稀土離子Tb3+對(duì)植物體內(nèi)外的HRP活性與結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果主要?dú)w納如下： 模擬生理溶液中，輕稀土離子La3

3、+對(duì)HRP活性的影響隨稀土濃度升高呈現(xiàn)“低促高抑(Hormesiseffect)”現(xiàn)象。產(chǎn)生這種效應(yīng)的成因是La3+改變了HRP的構(gòu)象。低濃度的La3+使HRP的多肽鏈構(gòu)象的有序結(jié)構(gòu)含量增加，無(wú)序結(jié)構(gòu)含量減少，使血紅素卟啉環(huán)中非平面性增加，導(dǎo)致HRP分子血紅素活性中心Fe(Ⅲ)暴露程度的增加，使得HRP分子電子傳遞更加容易，因而HRP分子的活性增加。高濃度的La3+會(huì)使HRP分子中的多肽鏈構(gòu)象的有序結(jié)構(gòu)含量減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)含量增加，整個(gè)分

4、子更趨近于松散，使血紅素卟啉環(huán)中平面性增加，導(dǎo)致HRP分子血紅素活性中心Fe(Ⅲ)的暴露程度減弱，使HRP分子電子傳遞更為困難，因而HRP分子的活性被抑制。La3+可以和HRP分子中多肽的酰胺發(fā)生相互作用，改變多肽鏈的構(gòu)象，從而對(duì)活性中心產(chǎn)生微擾。低濃度的La3+和HRP相互作用，只是改變了HRP的構(gòu)象，其中并沒(méi)有La-HRP配合物生成。高濃度的La3+和HRP相互作用，有La0.88-HRP配合物生成，0.44摩爾Ca(Ⅲ)被La3+

5、取代。HRP中Ca(Ⅱ)的丟失將導(dǎo)致HRP活性的降低。進(jìn)一步解釋了HRP的活性被高濃度的La3+所抑制的現(xiàn)象。在La0.88-HRP配合物中，La3+和HRP多肽鏈酰胺的氧原子或氮原子形成共價(jià)鍵，使整個(gè)分子電子云密度重新分配，從而導(dǎo)致HRP分子生物活性的變化。 辣根體內(nèi)HRP的活性隨La3+濃度的升高也呈現(xiàn)出低促高抑現(xiàn)象。低濃度的La3+處理辣根，稀土離子不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上有少量稀土存在，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整，葉

6、綠體類囊體的片層結(jié)構(gòu)增加，能促進(jìn)HRP的酶蛋白的合成和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用，如，鈣，鐵。低濃度La3+對(duì)辣根生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用，此時(shí)，辣根體內(nèi)沒(méi)有La-HRP生成。高濃度的La3+處理辣根，稀土能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，HRP大多集中在細(xì)胞壁上，造成細(xì)胞衰老，對(duì)辣根植物生長(zhǎng)起到抑制作用。在該條件下，辣根體內(nèi)生成La-HRP配合物，其中La3+和HRP肽鏈上的氧原子或氮原子結(jié)合，La-HRP的分子量為43833Da，pI8.76，大約1摩

7、爾的La3+鍵合到1摩爾的HRP上形成1摩爾的La-HRP。HRP和La-HRP的性質(zhì)對(duì)比研究表明，La-HRP的構(gòu)象和微結(jié)構(gòu)不同于HRP。兩者相比，La-HRP血紅素基團(tuán)的平面性增加，活性中心Fe(Ⅲ)的電子云密度減小，從而使La-HRP的電化學(xué)和催化活性被抑制，這可能是La3+抑制辣根體內(nèi)過(guò)氧化物酶的機(jī)理之一。熒光顯微鏡的結(jié)果表明La-HRP經(jīng)食物鏈進(jìn)入生物體，將被吸附在細(xì)胞膜上而影響膜的正常生理功能，對(duì)細(xì)胞造成傷害。 在

8、模擬生理溶液中Tb3+和HRP相互作用，主要是抑制HRP催化活性，Tb3+的這種抑制作用程度隨Tb3+濃度的增加而增強(qiáng)。Tb3+可以和HRP分子中多肽的酰胺發(fā)生相互作用，改變了HRP多肽鏈的構(gòu)象，從而對(duì)活性中心產(chǎn)生微擾。Tb3+使HRP分子中的多肽鏈構(gòu)象的有序結(jié)構(gòu)含量減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)含量增加，整個(gè)分子更趨近于松散，使血紅素卟啉環(huán)中平面性增加，導(dǎo)致HRP分子血紅素活性中心Fe(Ⅲ)暴露程度的減弱，使得HRP分子電子傳遞更為困難，因而HRP分

9、子的活性受抑制。MALDI-TOF/MS和XPS結(jié)果表明Tb3+對(duì)HRP活性產(chǎn)生抑制作用的實(shí)質(zhì)是有Tb2-HRP配合物生成，其中平均每摩爾Tb2-HRP含有約2摩爾的Tb3+。在Tb2-HRP配合物中，Tb3+和HRP多肽鏈的氧原子形成共價(jià)鍵，使整個(gè)分子電子云密度重新分配，從而導(dǎo)致HRP分子生物活性的變化。 Tb3+處理辣根，Tb3+對(duì)HRP的抑制作用是主要的，對(duì)各項(xiàng)生理指標(biāo)都表現(xiàn)出傷害效應(yīng)，此時(shí)Tb3+起到重金屬離子的作用。

10、電鏡自顯影結(jié)果顯示Tb3+大多集中分布在細(xì)胞壁上，少量Tb3+能進(jìn)入原生質(zhì)體，并主要分布在液泡內(nèi)，葉綠體內(nèi)和葉綠體膜上。而此時(shí)HRP大多集中在細(xì)胞壁上，造成細(xì)胞衰老，對(duì)辣根植物生長(zhǎng)起到抑制作用。在該條件下，辣根體內(nèi)生成Tb4-HRP配合物，Tb4-HRP的分子量為44336Da，pI8.80，大約4摩爾的Tb3+鍵合到1摩爾的HRP上形成1摩爾的Tb4-HRP，同時(shí)有0.21摩爾的鈣被Tb3+取代。HRP和Tb4-HRP的性質(zhì)對(duì)比研究表

11、明，Tb4-HRP的形成改變了HRP的構(gòu)象和微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致血紅素基團(tuán)的平面性增加，活性中心Fe(Ⅲ)的暴露程度減小，從而使Tb4-HRP的電化學(xué)和催化活性被抑制，這可能是Tb3+抑制辣根體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性的機(jī)理之一。熒光顯微鏡的結(jié)果表明Tb4-HRP經(jīng)食物鏈進(jìn)入生物體，將被吸附在細(xì)胞膜上而影響膜的正常生理功能，對(duì)細(xì)胞造成傷害。 在稀土農(nóng)用時(shí)，要慎重選擇稀土離子應(yīng)該為輕稀土離子如鑭，并控制在較低的濃度范圍。重稀土離子如鋱對(duì)植物生長(zhǎng)