生地黃多糖免疫調(diào)節(jié)作用實驗研究.pdf

1、　　近年來,人們越來越多的關(guān)注于中草藥對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用,通過對這些中草藥免疫調(diào)節(jié)功能的研究,有助于開發(fā)出具有臨床應(yīng)用價值的免疫調(diào)節(jié)劑。
　　地黃為玄參科(Scrophulariaceae)植物地黃 (Rehmannia glutinosa L.)的新鮮或干燥塊根,是常用的一種傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥。生地黃為地黃的干燥塊根,具有清熱涼血,養(yǎng)陰生津之功效[1]。熟地黃為生地黃的加工炮制品,具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓之功效。

2、　　國內(nèi)外對地黃的化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用等進(jìn)行了大量研究,研究發(fā)現(xiàn)地黃可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。本實驗室前期侯委位師姐采用 95%乙醇回流藥渣水提法,分別得到生地黃的 95%乙醇提取物、藥渣水提物、粗多糖和藥渣水提物去多糖部位。通過體外淋巴細(xì)胞增殖實驗研究發(fā)現(xiàn)生地黃發(fā)揮免疫低下作用的有效部位為 95%乙醇提取物和藥渣水提物去多糖部位；發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的有效成分為粗多糖成分。提示生地黃粗多糖具有免疫增強(qiáng)作用。
　　前期研究主要

3、作了體外免疫篩選實驗,接下來我們擬對生地黃多糖成分的免疫增強(qiáng)作用作進(jìn)一步的體外和體內(nèi)驗證實驗。包括生地黃多糖對淋巴細(xì)胞增殖實驗和免疫低下小鼠模型實驗,為進(jìn)一步探討生地黃的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　目的：考察生地黃多糖體外免疫調(diào)節(jié)作用,以及生地黃多糖對免疫低下模型的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法：生地黃95%乙醇部位多糖提取物(下文簡稱RPE)：將生地黃切厚片,稱取9.8 kg,加入10倍量 (w/v=1：10

4、) 95%乙醇回流提取2次,每次2 h,合并濾液減壓濃縮干燥后用水溶,水溶液上Diaion HP-20柱,用水洗脫后合并濾液減壓濃縮干燥得到生地黃95%部位多糖1.4582 kg,得率14.88%。
　　生地黃水部位多糖提取物(下文簡稱RPW)：剩余藥渣加入10倍量 (w/v=1：10) 蒸餾水在水浴中提取2次 ,每次2 h,合并濾液減壓濃縮干燥,得藥渣水提物。藥渣水提物加入適量蒸餾水超聲溶解后,再加入95%乙醇至醇含量在80

5、%以上,不斷攪拌,有大量沉淀產(chǎn)生,4℃過夜,6000 r·min-1,離心15min,分別收集沉淀和上清液,上清液減壓濃縮后,重復(fù)上述操作,收集后的沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚相繼洗滌,減壓濃縮干燥,即得生地黃水部位多糖提取物1.6836 kg,得率17.18%。
　　體外實驗中,常規(guī)分離Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴細(xì)胞,通過MTT法檢測RPE、RPW對小鼠胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖水平。
　　體內(nèi)實驗采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)

6、免疫低下小鼠模型,通過小鼠單核吞噬細(xì)胞碳粒廓清率實驗檢測生地多糖對免疫低下小鼠固有免疫的影響；通過血常規(guī)、臟器指數(shù)、ELISA法、流式細(xì)胞術(shù)檢測生地多糖對免疫低下小鼠適應(yīng)性免疫的影響。
　　結(jié)果：體外實驗結(jié)果顯示,與Con A刺激前對照組相比,RPW 1 mg·mL-1、RPE 1 mg·mL-1劑量組均可顯著性促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞增殖 (P<0.05)；RPW 10 mg·mL-1、RPE10 mg·mL-1劑量組均可極顯著性促

7、進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞增殖 (P<0.01)。Con A刺激后,與Con A刺激前對照組相比,Con A可極顯著性促進(jìn)其細(xì)胞增殖(P<0.01)；RPW、RPE各劑量組均可進(jìn)一步顯著性促進(jìn)其細(xì)胞增殖 (P<0.01,P<0.05)。
　　與Con A刺激前對照組相比,RPW 1 mg·mL-1劑量組可顯著性促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖 (P<0.05)；RPW 0.1 mg·mL-1、10 mg·mL-1、RPE 0.1 mg·mL-1、1 m

8、g·mL-1、10 mg·mL-1劑量組均可極顯性著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖 (P<0.01)。Con A刺激后,與Con A刺激前對照組相比,Con A可極顯著性促進(jìn)脾細(xì)胞增殖(P<0.01),RPW、RPE各劑量組均可進(jìn)一步極顯著性促進(jìn)脾細(xì)胞增殖 (P<0.01)。
　　免疫低下小鼠模型實驗結(jié)果顯示生地多糖對免疫低下模型小鼠體重影響無統(tǒng)計學(xué)差異；能夠顯著提高免疫低下小鼠體內(nèi)吞噬系數(shù) K(P<0.05)并有提高吞噬指數(shù) α 的趨勢

9、；顯著提高血液白細(xì)胞數(shù)(P<0.01)、血小板數(shù)(P<0.01)、淋巴細(xì)胞數(shù)(P<0.01)及中性粒細(xì)胞數(shù)(P<0.05),對紅細(xì)胞數(shù)的影響和模型組相比無差異；RPW可以顯著提高免疫低下小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01),對胸腺指數(shù)的影響和模型組相比無差異,RPE可以顯著提高免疫低下小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)及脾臟指數(shù)(P<0.01)；顯著提高 IFN-γ(P<0.01)、IL-4(P<0.01)、IL-10(P<0.01)的表達(dá)水平,顯著

10、降低TNF-α(P<0.01)、IL-17(P<0.01)的表達(dá)水平；顯著提高脾淋巴細(xì)胞CD3+CD4+的表達(dá)水平(P<0.01),降低 CD3+CD8+的表達(dá)水平( P<0.01 ),提高脾淋巴細(xì)胞 CD3+CD4+/CD3+CD8+比值(P<0.01)。
　　結(jié)論：生地黃多糖提取物具有顯著的體外免疫增強(qiáng)作用,RPW、RPE均可顯著性促進(jìn)Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞增殖。
　　實驗結(jié)果顯示生地黃多